זה פרוטוקול פרטים שיטה למדידת כמותית של טרנסלוקציה הפפטיד לתוך שלפוחית גדולה השומנים unilamellar. שיטה זו מספקת גם מידע על שיעור של טרנסלוקציה בממברנה והוא יכול לשמש כדי לזהות את הפפטידים זה ביעילות באופן ספונטני לחצות bilayers השומנים.
יש עניין פעיל פפטידים בקלות לחצות קרום התא ללא סיוע של קולטני קרום התא 1. רבים מהם מתייחסים כאל תא חודר פפטידים, אשר ציין לעיתים קרובות את הפוטנציאל שלהם בתור משלוח סמים וקטורים 1-3. יתר על כן, יש עניין גובר פפטידים מיקרוביאלית שפועלים דרך הממברנה ללא מנגנוני ממס 4,5, במיוחד אלו לחצות קרומים חיידקיים ללא גרימת תמוגה התא ולהרוג תאים על ידי הפרעה תהליכים תאיים 6,7. למעשה, החוקרים הצביעו יותר ויותר את הקשר בין פפטידים התא חודר מיקרוביאלית 1,8. הבנה של המשרד בתהליך של טרנסלוקציה קרום ואת הקשר בין מבנה הפפטיד ואת יכולתו translocate דורש יעילות, מבחני לשחזור עבור טרנסלוקציה. כמה קבוצות הציעו שיטות למדוד טרנסלוקציה לתוך unilamel גדולהשומנים שלפוחית lar ('לאב') 13/09. 'לאב' כמודלים שימושיים קרום התא של חיידקים האיקריוטים והם משמשים לעתים קרובות במחקרים פלורסנט פפטיד 14,15. כאן, אנו מתארים את היישום שלנו של השיטה שפותחה לראשונה על ידי Matsuzaki ועמיתים לעבודה לשקול פפטידים מיקרוביאלית, כגון magainin ו buforin II 16,17. בנוסף לאספקת פרוטוקול שלנו עבור שיטה זו, אנו גם מציגים גישה פשוטה לניתוח נתונים מכמת היכולת טרנסלוקציה באמצעות assay. היתרונות של assay זה טרנסלוקציה לעומת אחרים כי יש לו את הפוטנציאל לספק מידע על שיעור של טרנסלוקציה בממברנה ואינו דורש תוספת של תווית ניאון, אשר יכול לשנות תכונות פפטיד 18, אל טריפטופן המכיל פפטידים. בקיצור, היכולת טרנסלוקציה לתוך שלפוחית שומנים בדם נמדדת כפונקציה של העברת אנרגיה תהודה פוסטר (סריג) בין שאריות טריפטופן יליד דansyl phosphatidylethanolamine כאשר חלבונים הקשורים החיצוני LUV הקרום (איור 1). Cell-חודר פפטידים הם ביקע כפי שהם נתקלים טריפסין מעצורים במארז עם 'לאב', המוביל ההתנערות מן הקרום LUV ועל ירידה סריג האות. הירידה סריג האות שנצפה עבור פפטיד translocating הוא גדול משמעותית מזה שנצפה עבור פפטיד זהה כאשר 'לאב' מכילים הן טריפסין ו מעכב טריפסין, או כאשר פפטיד זה לא ספונטני לעבור ממברנות שומנים בדם נחשף טריפסין המכילים 'לאב'. שינוי זה מספק כימות הקרינה הישירה של טרנסלוקציה פפטיד לאורך זמן.
הפרוטוקול המובא כאן יכול לשמש כדי להעריך את השינוי היחסי בריכוז של פפטידים ומחוצה שלפוחית השומנים. שינויים אלה קשורים ליכולת טרנסלוקציה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות תאים חודר פפטידים עם פוטנציאל כמו וקטורים משלוח סמים. כאשר הריבית בתא חודר פפטידים גדל, זה יהי…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות אלינור פלמינג ג'סיקה חן לדיונים מועילים. המימון ניתן על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIH-NIAID) פרס R15AI079685 לבין תאגיד מחקר קוטרל פרס קולג' למדע. תמיכה סטודנט נוסף סופק על ידי הווארד יוז רפואי במכון ואת קרן סטנלי.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
16:0-18:1 PG | Avanti Polar Lipids | 840457C |
1:18 Dansyl PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
16:0-18:1 PC | Avanti Polar Lipids | 850457C |
Porcine trypsin | Sigma | T-0303 |
Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor | Sigma | T-9777 |
Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 |
Ammonium molybdate (para) | Alfa Aesar | 10811 |
L-ascorbic acid | Sigma | A1417 |
Hydrogen Peroxide, 30% solution | Mallinckrodt chemicals | 5240-05 |
HEPES | Sigma | H-3375 |
NaCl | Sigma | S-9625 |
EDTA | Sigma | E5134 |
NaH2PO4 | Sigma | S-0751 |