דרך מהירה לבצע immunostaining לב עוברי דג הזברה הוא תיאר. לעומת הגישה הר שלם immunostaining, שיטה זו מגדילה באופן דרמטי את החדירה של נוגדנים, אשר מאפשר קבלת תמונות ברזולוציה גבוהה החושפים מבנים הסלולר / subcellular בלב תוך זמן עיבוד מופחת בהרבה.
Abstract
עובר דג הזברה הופך פופולרי מודל חוליות vivo לחקר התפתחות לב ומחלות לב אדם עקב אמבריולוגיה יתרון שלה בגנטיקה 1,2. אודות 100-200 עוברי זמינים בכל שבוע מזוג אחד של דגים בוגרים. עוברי שקוף המתפתחים ברחם לשעבר להפוך אותם אידיאליים להערכת פגמים לב 3. הביטוי של הגן כל ניתן להשפיע באמצעות morpholino טכנולוגיית הזרקה או RNA 4. יתר על כן, קדימה מסכי גנטית יצרו כבר רשימה של מוטציות שעלולות להשפיע על היבטים שונים של cardiogenesis 5.
הר שלם immunostaining היא טכניקה חשובה במודל זה חיה כדי לחשוף את דפוס הביטוי של החלבון ברקמות ממוקדות מסוים 6. עם זאת, תמונות ברזולוציה גבוהה שיכולים לחשוף מבנים הסלולר או subcellular היה קשה, בעיקר בשל locat הפיזייון של הלב חדירה לקויה של הנוגדנים.
כאן, אנו מציגים שיטה כתובת אלה צווארי בקבוק ידי ביתור הלב הראשון ולאחר מכן לנהל את התהליך מכתים על פני השטח של המיקרוסקופ שקופית. כדי למנוע אובדן של דגימות לב קטן כדי להקל על הטיפול פתרון, אנחנו מוגבלים דגימות לב בתוך עיגול על פני השטח של המיקרוסקופ מגלשות רתומות עט immEdge. לאחר מכתים, אותות הקרינה ניתן לצפות ישירות על ידי מיקרוסקופ המתחם.
השיטה החדשה שלנו משפר באופן משמעותי את החדירה של נוגדנים, שכן לב מהדגים עובריים רק מורכב משכבות תאים בודדים. תמונות באיכות גבוהה של לבבות שלמים ניתן להשיג תוך זמן התהלוכה הרבה מופחת עבור עוברי דג הזברה בן 2 מיום ליום 6. בשיטה שלנו ניתן להאריך פוטנציאל כתם איברים אחרים גזור מן דג הזברה או חיות קטנות אחרות.
Protocol
1. הכנת שקופיות קאמרית humidified החדר humidified ניתן מתיבת כגון תיבת קצה התרוקן. לעטוף גם את החדר ואת לכסות ברדיד אלומיניום כדי להגן על דגימות מן האור. בתוך החדר, לשים ערימה של מגבות נייר רטוב כדי לשמ?…
Discussion
לעומת שיטות קלאסיות immunostaining כל הר, בשיטה שלנו יש את היתרונות הבאים. ראשית, אותות ניאון חזק הרבה יותר ניתן להשיג באופן עקבי בשל חדירה משופרת. ב שיטת הר שלם immunostaining, רקמת העור צפוף המקיף את הלב משמעותית את החדירה של נוגדנים רבים, וכתוצאה מכך רקע גבוה בכל הגוף. בעיה זו חמור…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Beninio Jomok על עזרתו בעלי דג הזברה. עבודה זו ממומנת על ידי NIH HL81753.
Materials
Name of the reagent
Company
Catalogue number
tricaine
Research organics
3007T
Formaldehyde
Polysciences
04018
Insulin syringe
Becton Dickinson
329461
Triton-X-100
Sigma
T8532
Anti-β-catenin antibody
Sigma
C7207
Anti-Mef2c antibody
Santa Cruz Biotech
SC313
F59
Zfin
Anti-α-actinin antibody
Sigma
A7811
Anti-Ilk antibody
Cell signaling
#3862
Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG
Invitrogen
A11011
Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1
Invitrogen
A21121
Mounting medium for fluorescence
Vector
H-1200
ImmEdge pen
Vector
H-4000
Poly-L-lysin coated slides
Electron microscopy sciences
63410-01
Microscope cover glass
Fisher
12-543-D
Concaved microscope slides
Fisher
7-1305-8
Dissection microscope
Leica MZ95
Compound microscope
Zeiss
Axioplan2
ApoTome
Zeiss
PBST:
1 x PBS
0.5% Triton-X 100
25X Tricaine:
400 mg Tricaine
97.9 mL ddH2O
2.1 mL (1M Tris pH9)
Adjust pH to 7.0