Изображениями феромонов зондирования в мышь вомероназального острого Подготовка фрагментов тканей

Summary

У мышей способность обнаруживать феромоны в основном при посредничестве вомероназального орган (ВНО). Здесь, острый срез подготовки ткани для проведения ВНО кальция изображений описан. Эта физиологическая подход позволяет наблюдений субпопуляций и / или отдельных нейронов в живой ткани и удобен для рецептор-лиганд идентификации.

Abstract

Peter Karlson and Martin Lüscher used the term pheromone for the first time in 1959¹ to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules² secreted and/or contained in biological fluids^3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones³. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions^5,6, hierarchical organisations³ and sexual interactions^7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species^9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)^10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen^13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)¹⁵. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection¹⁶. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize^17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs^19,20,21,22, are composed respectively by 240²³ and 120²⁴ members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)²⁵ and formyl peptide receptors (FPRs)^26,27 are also expressed in VSNs.

Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons²⁸ TRPC2 independent transduction channels have been suggested^6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.

Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line³⁰, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

Protocol

1. Препарирование мышей ВНО Использование взрослых мышей. Как феромона зондирования замешана в multimodalities, тщательное различие между штаммами, генотипы, пола и возраста имеет важное значение и будет влиять на ваши результаты. Здесь, мы решили взрослых мышей В. 30 ранее использовались для идентификации феромон-рецепторов паре (2-heptanone-V1rb2) 31 (рис. 1А). Перед началом вскрытия, подготовки свежей холодной искусственной спинномозговой жидкости (ACSF; NaCl 118 мм, NaHCO 3 25 мм, D-глюкозы 10 мМ KCl 2 мМ, MgCl 2 2 мМ NaH 2 PO 4 1,2 мМ CaCl 2 2 мМ, рН 7,4), насыщенный oxycarbon (95% O 2: 5% CO 2). Для этого смешайте все компоненты, за исключением ACSF CaCl 2. Пропитайте решения, непосредственно восходящей его oxycarbon. В конце добавить CaCl 2 и отрегулировать с DDH 2 0 до желаемого объема. Хранить раствор ACSF на льду, пока укак таковой. Эвтаназия в мышь должна быть преимущественно сделано шейки дислокации или CO 2 ингаляции перед экспериментом. Вырезать мышь головы. Поместите его под микроскопом рассекает в холодной ACSF непрерывно oxycarbonated. Отрежьте нижнюю челюсть и положение головы для того, чтобы визуализировать неба (рис. 1б). Сделайте разрез горизонтально в верхней части неба (рис. 1б) с микро-ножницы и удалить неба мембраны с микро рассекает щипцами. Гидратов и чистой подвергается полости с ACSF (рис. 1в). Отрежьте верхнюю и нижнюю часть носовой перегородки (рис. 1в). Деликатно экстракт носовой перегородки содержащие ВНО и поместить его прямо в ACSF на льду (рис. 1D). Отдельные вертикально две части ВНО с использованием микро рассекает пинцетом и аккуратно удалить хрящевую капсулу ВНО (Рис. 1E). Убедитесь, что все хрящевые части удаляются. 2. ВНО ткани срез подготовки Ломтик ВНО подготовки ткани, описанные в данном разделе 2) предназначен в основном для исследования кальция изображений. ВНО ломтиками также может быть использован для immunohistostainings на плавучих ломтиками для проверки структурной целостности тканей (см. раздел 3) из протокола). Подготовка легкоплавких агар (3% в стандартных PBS) и рабочее место. Вам нужно будет ACSF, микротома и поддерживает, микро рассекает щипцы, вложение формы (22 х 22 х 20 мм), точность салфетки, щетки, тарелки культуре тканей, cyanacrylat клей, льда и термометр. Заполните форму вложения с 3% легкоплавких агара. Убедитесь, что температура не выше 41 ° C до размещения вертикально вскоре уничтожены ВНО (рис. 2), чтобы иметь возможность получить корональных ломтиками. Место вложение плесень на льдув течение 1 мин до затвердевания, а затем отделить его от агара блока. Вырезать агар блока в пирамидальную форму и разместить его с клеем на микротома поддержки (рис. 2В). Вырезать корональных ломтиками ВНО с микротома, со скоростью 0,5 мм / с, амплитуда 0,7 мм и толщиной 100 мкм в холодной ACSF и собирать срезах тканей с кистью перед помещением их в пластину культуре ткани заполнены холодной ACSF. Если ваш ломтики содержать эндогенные флуоресценции, как GFP (в ген-целевых нейронов) вы можете выбрать их под люминесцентными стереомикроскопа (рис. 2). 3. Immunohistochemistry на ВНО плавающие ломтики Целью этой процедуры является проверка целостности ткани ВНО ломтиками, полученные в разделе 2). Ацетилированный-тубулина является микротрубочек / цитоскелета маркер выражается в дендритов и микроворсинки ВНО сенсорных нейронов. Для экспериментов кальция изображений, перейдите направленииTLY раздел 4) протокола. Immunohistostaining метод плавающей ломтиками ВНО может быть адаптирована к оценке выражения какого-либо белка, представляющих интерес. Для этого, мы рекомендуем вам исправить ВНО в течение 1 ч при температуре 4 ° С в фиксирующий раствор (4% параформальдегида в PBS, рН 7,6) после точки 1,7) протокола и использовать с этой точки PBS при рН 7,6, а не ACSF решение. В пластине культуре ткани, исправить ваши ломтики интерес к фиксирующий раствор (4% параформальдегида в PBS, рН 7,6) 1 час при температуре 4 ° C. Блок ваши срезы тканей ночи при 4 ° С в растворе PBS, содержащего NGS (обычный козел сыворотки) 10% и тритона Х-100 на уровне 0,5%. Инкубируйте ломтики с первичными антителами (анти-ацетилированного-тубулина, Мышь, 1:2000) для 16h при комнатной температуре (RT) в растворе PBS, содержащего NGS 5% и Тритон Х-100 на 0,25%. Промыть 3 раза в течение 5 минут с раствором PBS, содержащего NGS 2%. Инкубировать в темноте с SECOndary антител (Cy5-сопряженных антимышиного, 1:200) в растворе PBS, содержащего NGS 2% в течение 1 ч при комнатной температуре. Промыть 3 раза в течение 5 минут с PBS содержащие NGS 2%, PBS NGS 1% и только PBS. Смонтируйте ломтики в флуоресцентные монтажа СМИ (содержащие или не DAPI), поместив их в центре гидрофобные зоны запятыми (использование гидрофобных ручкой) и сопроводительное ломтики покровные. Провести наблюдения и поглощений с конфокальной микроскопии и программного обеспечения, позволяющего 3D реконструкции (рис. 2D-F). 4. Кальций изображения на кусочки ВНО Следующие процедуры будут проходить в темное время суток. Инкубируйте ВНО ломтики в течение 1 ч при температуре 37 ° С в загрузке раствор, состоящий из холодных ACSF с Фура-2 утра (7 мкМ; маточного раствора 1 мМ в ДМСО) и плуроник 0,1% (м / о; маточного раствора на 20% в DDH 2 O). Держите загружены ломтики на льду с oxycarbonation до использования. Загружено ломтиками может храниться в течение3-4h. Место загружены ломтики с кистью в перфузионной камере, содержащей ACSF и поддерживать ломтики с якоря ткани срез (рис. 3А). Место перфузии камеры на стадии микроскоп кальция томография (рис. 3В) и постоянно обрызгивать с oxycarbonated ACSF при комнатной температуре. Температура может быть адаптирована с использованием регулятора температуры биполярного. Наблюдения загружены ломтиками ВНО (рис. 3C-E) выполняются с перевернутой флуоресцентного микроскопа, с 25x или 63x объективных и CooL SNAP-HQ камеры. Освещение осуществляется последовательно (340/380 нм) с инструментом полихроматор и записаны со скоростью 5 Гц. Фильтрованный выбросов осуществляется при 510 нм. Внутриклеточного кальция соотношение изменяется (ΔF = 340 nm/380 нм) контролируются с соответствующим программным обеспечением. Chemostimulation должны быть выбраны в соответствии с вашими экспериментальных целях. Здесь перфузии из ACSF содержащие феромоны мIX (изобутиламина, 2-heptanone, 4-heptanone, 2-гептанола, pentylacetate, dimethylpyrazine, α / β-farnesene, 10 -6 М), 2-heptanone (10 -6 М) или только что собранных мужские и женские (1: 1) мышь мочи (1:100) выполняются 32. Перфузии АТФ (125 мкМ) используется как жизнеспособность тест в конце эксперимента (рис. 3F) и указать, доля около 80% жизнеспособных нейронов. В этих условиях, кусочки можно использовать до 2-х часов. GFP с метками субпопуляций сенсорные нейроны визуализируются конкретными освещения (здесь V1rb2 выражения нейронов) и может быть проанализирована точно (рис. 3G-I). 5. Представитель Результаты: Для создания функционального анализа для исследования несколько путей трансдукции, происходящие в ВНО мыши, или для выявления новых феромон-рецепторов пар, мы воспользуемся В. Г. мыши линии (рис. 1А </stroнг>). В этой линии, одна из 240 V1Rs рецепторы, V1Rb2 рецептор GFP с тегами позволяет легко визуализировать частности субпопуляции вомероназального сенсорных нейронов. После извлечения и вскрытия ВНО (рис. 1E), мы готовим острые ломтики ВНО (рис. 2). Зафиксируем часть из них, с тем чтобы проверить и подтвердить тканевой целостности подготовки, выполняя immunohistostainings против ацетилированного-тубулина белка (рис. 2D-F). Другая часть из ломтиков используется для экспериментов кальция изображений. Для этого ломтики загружаются с Фура-2 утра (рис. 3C-E) и внутриклеточного уровня кальция каждого нейрона контролируется как отношение ΔF (рис. 3F). Жизнеспособность нейронов оценивается перфузии АТФ (125 мкМ), после чего быстрое и кратковременное повышение отношения ΔF ожидается (рис. 3F). Моча будучи основным источником феромонов, перфузии свежейЛи собрал мыши мочи (1:100) используется в качестве эндогенного контроля. Это вызывает кальция переходных процессов в примерно 50% от записанного нейронов (ячейка 1 и 2, рис. 3F). Под GFP освещения, V1Rb2 положительные нейронов наблюдаются и перфузии ее известных феромонов лиганд, 2-heptanone, инициирует активации клеток (ячейка 1, рис. 3I). Интересно, что нейронные активаций также наблюдается в доле нейронов, которые не выражают V1Rb2 рецепторов (GFP отрицательный нейроны) (ячейка 2, рис. 3I), демонстрируя сложность кодирования феромонов в ВНО. Рисунок 1. Препарирование орган мыши вомероназального. (A) мышь от линии VG. (B) После эвтаназии мыши, полный голова находится под бинокулярным микроскопом и нижней челюсти удаляется для того, чтобы визуализировать неба. Небольшой горизонтальный разрез делается(Черная пунктирная линия). (C) После удаления неба, носовой перегородки выстланы ВНО разрезается в верхней и нижней части (белый пунктир) для облегчения ВНО добычи. (D) ВНО находится в растворе ACSF и отделены (вставить: высшая сила зрения двух частей). (E) хрящевая капсула ВНО является деликатно удаляют и ВНО без хрящевой капсулы используется для остальной части экспериментов. Шкала бары: BE, 1 мм. Рисунок 2. Мышь вомероназального острых подготовки нарезать и тканевой целостности. (А) ВНО мыши вертикально встроенных в агар 3% раствора. Температура агара должна быть ниже 41 ° C. (B) агар блок режут на пирамидальную форму и 100 мкм ВНО разделах (черный пунктир) генерируются в ACSF. (C) ВНО ломтиками может быть выбран под флуоресцентным стереомикроскопа для визуализации конкретныхНаселение меченых сенсорных нейронов. (DF) тканевой целостности можно оценить по immunohistostainings против ацетилированного-тубулина белка, увеличению мощности зрения V1rb2 гена ориентированных нейроны демонстрируют идеальное сохранение подготовки. Нейроны с длинными дендритов, достигающего поверхности просвета (E), а также выражение структурного белка в дендритные ручки и микроворсинок можно наблюдать (F). Шкала бары: В, 5 мм; С, 60 мкм, D, 40 мкм, EF, 20 мкм. Рисунок 3. Изображений Кальций и феромонов обнаружения в вомероназального острые ломтики тканей. () После Фура-2 утра загрузочной фазы, ВНО ломтиков помещают в перфузионной камере и поддерживаются с адаптированной якорь (высокий зрения власти). (Б) Эксперименты проводятся в темное и ВНО ломтиками постоянно озарен ACSF при комнатной температуре с вакуумной системой. Температура может быть Chosан с помощью системы регулятор температуры составленный элемент Пельтье и биполярного тепловой датчик. Данный эксперимент проводился при комнатной температуре. (CE), ВНО ломтики наблюдаемых под Хоффман фазового контраста (С, Hv) или 380 нм Фура освещения перед (D) и во время активации нейронов (E, здесь с АТФ). (F) нейронов жизнеспособность оценивается с перфузии АТФ (125 мкМ). Здесь chemostimulation осуществляется с мочой (моча, 1:100) или смесью мыши феромоны (смесь тел., 10 -6 М) с постоянной скоростью потока 165 мл / ч. Внутриклеточного уровня кальция (ΔF) могут быть записаны отдельно для каждой ячейки (Cell с 1 по 3). (G) нейрона V1Rb2 визуализируется при освещении GFP (1). (H) загрузку этого нейрона (1), а также не-V1rb2 выражения нейрона (2), показано на рисунке. (I) нейрона V1rb2 в состоянии ответить на 2-heptanone с увеличением внутриклеточного кальция. Это особенно не-V1rb2 выражения нейрон реагирует также на 2-heptanone (клетка 2). Шкала бары: CE, 20 мкм; GH,15 мкм; ΔF = 340 нм / 380 нм. (F и I) Продолжительность стимулом приложения указывается баров под каждым следа. Произвольном масштабе цвет соответствует интенсивности флуоресценции.

Discussion

Метод визуализации кальция, представленные здесь позволяет записывать, в остром подготовки ломтик, феромонов ответы нейронов мыши ВНО. При таком подходе, рассечение от животного к вомероназального нейронов, с некоторой практикой, легко достижимо и дает долгоживущих подготовки ткани. Он позволяет много времени эксперименты, как фармакологические исследования или изучения феромонов кодирования. При этом физиологические техники, большой численностью населения, а также точный нейронных субпопуляций могут быть проанализированы в частности. Кроме того, этот метод может быть легко адаптирована к иммуногистохимического подходы или экспериментов, основанных на других красителей кальция. Использование этих комбинированных методик, безусловно, позволяют выявлению новых феромонов лигандами для многих хеморецепторы сирот выражается в орган мыши вомероназального.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt solution (ATP)	Sigma-Aldrich	A6559-25UMO
Agar	Sigma-Aldrich	A7002-100G	Preferentially for immunohistochemistry
Agar (low-melting)	Sigma-Aldrich	A0701-25G	Preferentially for calcium imaging
CL-100 Bipolar Temperature Controller	Warner Instruments	W64-0352
Confocal Microscope	Leica Microsystems	SP5 AOBS
Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-175-071	Protect from light
DMSO (Dimethyl Sulfoxide)	Merck	317275-100ML
Embedding molds, Peel-A-Way	Polysciences	18646A-1	22 x 22 x 20 mm
Fluorescent mounting media (Vectashield with DAPI, 10 ml)	Rectolab	H-1200
FURA-2AM	Teflabs	0103	Protect from light
Glisseal N (vacuum grease, 60 g)	Borer Chemie	Glisseal N
Large bath recording chamber (RC-26G)	Warner Instruments	64-0235
MetaFluor (software for calcium imaging; v.7.6.5.0)	Visitron Systems
Monoclonal Anti-Tubulin, acetylated Mouse antibody	Sigma-Aldrich	T6793-.2ML
Normal goat serum (NGS, 10 ml)	Interchim	UP379030
Platform for chambers (P-1)	Warner Instruments	64-0277
Pluronic F-127, 2 g	Invitrogen	P-6867
Roti Coll (Dosing bottle, 10 g)	Carl Roth	0258.1
SC-20 Dual In-line Solution heater/Cooler	Warner Instruments	W64-0353
Slice anchor (SHD-26GKIT)	Warner Instruments	64-0266
Stereofluorescence microscope	Leica Microsystems	MZ16FA
Super PAP PEN (hydrophobic pen)	Pelco International	22309
Triton X-100	Fluka	93420-250ML
Vibrating blade microtome VT 1200S	Leica Microsystems	14048142066
VisiChrome high speed polychromator system	Visitron Systems
3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1)	Bitplane Scientific Software