마우스에서 페로몬을 감지하는 능력은 원칙적 vomeronasal 기관 (VNO)에 의해 중재됩니다. 여기, 칼슘 이미징을 수행하는 VNO의 급성 조직 슬라이스 준비가 설명되어 있습니다. 이것은 생리적 접근 방식은 살아있는 조직에 subpopulations 및 / 또는 개별 뉴런의 관찰이 가능하고 수용체 – 리간드 식별 편리합니다.
피터 Karlson과 마틴 Lüscher는 내부 종 (species) 통신에 사용되는 화학 물질을 설명하기 위해 1959 1 처음 용어 페로몬를 사용합니다. 페로몬은 휘발성 또는 비휘발성 수명이 짧은 분자이 분비 및 / 또는 소변, 페로몬 3 주 원본으로 알려진 액체로 생물 학적 체액 3,4에 포함되어 있습니다. Pheromonal 통신 등 가족과 상호 작용 5,6, 계층적 조직 3 성적 상호 작용 7,8 등 주요 동물 modalities 다양한 연루되고 결과적으로 직접 주어진 종 9,10,11의 생존과 상관 있습니다. 마우스에서 페로몬을 감지하는 능력은 원칙적 vomeronasal 기관 (VNO) 10,12, 비강의 기지에 위치한 이점 구조에 의해 중재되며, 연골 캡슐에 동봉. 각 VNO는 외부와 접촉을 허용 루멘 13,14와 관 모양을 가지고화학의 세계. 감각 neuroepithelium은 주로 vomeronasal 바이폴라 감각 뉴런 (VSNs) 15로 구성되어 있습니다. 각 VSN 화학 감지 16 연루 100 microvilli 최대 베어링 큰 돌기 손잡이로 끝나는 루멘에 하나의 dendrite를 확장합니다. VSNs 수많은 subpopulations이 흐릅니다. 그들은 그들이 17,18을 인식 리간드 (들)에 의해 가능하게함으로써 표현하고 chemoreceptor으로 구분됩니다. 두 가지 주요 vomeronasal 수용체 가족, V1Rs 및 V2Rs 19,20,21,22은 240 23 120 24 회원 각각 구성되어 있으며, neuroepithelium 별도의 레이어에 표현됩니다. 후각 수용체 (ORs) 25 메티오닌 펩타이드 수용체는 (FPRs) 26,27도 VSNs로 표현됩니다.
이들의 연결 subpopulations가 감지 페로몬에 동일한 스트림 신호 경로를 사용 여부에 상관없이 알 수 있습니다. 칼슘 투과 채널 (에 의해 연주 중요한 역할에도 불구하고성숙한 뉴런 28 TRPC2 독립 전달 채널의 microvilli에 존재 TRPC2)는 6,29 제안되었습니다. 의 연결을 subpopulations의 높은 번호와 오르간의 독특한 형태로 인해, VNO에있는 신호 요소의 약리 및 생리 조사가 복잡하고 있습니다.
여기, 우리는 칼슘 이미징 조사를 수행하기위한 마우스 VNO의 급성 조직 슬라이스 준비를 제시한다. 이것은 생리적 접근은 이전 Fura – 오전 2시, 칼슘 색소를로드 VSNs의 일반 또는 개별 subpopulations의 살아있는 조직의 자연 환경에서 관찰하실 수 있습니다. 이 방법은 GFP – 태그 페로몬 수용체를 공부 또한 편리합니다 그리고 다른 형광 칼슘 프로브의 사용에 대한 적응이다. 예를 들어, 우리는 여기 페로몬 V1rb2 수용체의 번역이 polycistronic 전략에 의한 GFP의 표현에 연결되어있는 VG 마우스 라인 30 사용합니다. </p>
여기에 제시 칼슘 이미징 방법은, 급성 슬라이스 준비, 마우스 VNO의 뉴런의 반응을 기록 pheromonal 수 있습니다. 이 방법으로 vomeronasal 뉴런에 대한 동물의 해부는 연습과 함께, 쉽게 달성되고 오랫동안 살아있는 조직 준비를 제공합니다. 그것은 약리 조사 또는 pheromonal 코딩의 연구와 같은 시간이 많이 소요 실험을 수 있습니다. 이 생리적 기법으로, 큰 인구뿐만 아니라 정확 subpopulations의 연결은 특히 분석하실 수 있습니다. 또한,이 방법은 쉽게 다른 칼슘 염료에 따라 immunohistochemical 접근이나 실험에 적용할 수 있습니다. 이러한 조합 방법의 사용은 반드시 마우스 vomeronasal 기관 표현 수많은 고아 chemoreceptors에 대한 새로운 pheromonal 리간드의 신분을하실 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 그의 과학적인 조언과 현미경 장비에 UNIL의 이미징 CIF 플랫폼에 특히 모니크 Nenniger 그녀의 뛰어난 기술 지원 Tosato뿐만 아니라 장 – 이브 Chatton 감사드립니다. 자금은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 제공되었다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt solution (ATP) | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | |
Agar | Sigma-Aldrich | A7002-100G | Preferentially for immunohistochemistry |
Agar (low-melting) | Sigma-Aldrich | A0701-25G | Preferentially for calcium imaging |
CL-100 Bipolar Temperature Controller | Warner Instruments | W64-0352 | |
Confocal Microscope | Leica Microsystems | SP5 AOBS | |
Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-175-071 | Protect from light |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Merck | 317275-100ML | |
Embedding molds, Peel-A-Way | Polysciences | 18646A-1 | 22 x 22 x 20 mm |
Fluorescent mounting media (Vectashield with DAPI, 10 ml) | Rectolab | H-1200 | |
FURA-2AM | Teflabs | 0103 | Protect from light |
Glisseal N (vacuum grease, 60 g) | Borer Chemie | Glisseal N | |
Large bath recording chamber (RC-26G) | Warner Instruments | 64-0235 | |
MetaFluor (software for calcium imaging; v.7.6.5.0) | Visitron Systems | ||
Monoclonal Anti-Tubulin, acetylated Mouse antibody | Sigma-Aldrich | T6793-.2ML | |
Normal goat serum (NGS, 10 ml) | Interchim | UP379030 | |
Platform for chambers (P-1) | Warner Instruments | 64-0277 | |
Pluronic F-127, 2 g | Invitrogen | P-6867 | |
Roti Coll (Dosing bottle, 10 g) | Carl Roth | 0258.1 | |
SC-20 Dual In-line Solution heater/Cooler | Warner Instruments | W64-0353 | |
Slice anchor (SHD-26GKIT) | Warner Instruments | 64-0266 | |
Stereofluorescence microscope | Leica Microsystems | MZ16FA | |
Super PAP PEN (hydrophobic pen) | Pelco International | 22309 | |
Triton X-100 | Fluka | 93420-250ML | |
Vibrating blade microtome VT 1200S | Leica Microsystems | 14048142066 | |
VisiChrome high speed polychromator system | Visitron Systems | ||
3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) | Bitplane Scientific Software |