Basophil 인증 테스트 IGE에 의존 알레르기의 탐지를위한 강력한 도구입니다<em> 체외에서</em>. 여기, basophil 활성화 시험에 대한 최적화된 프로토콜이 약물 과민성을 조사하는 데 사용됩니다. 공유 결합 약물 단백질 conjugates 및 물리 특성의 효율적인 생산 방법을 설명합니다.
propyphenazone (PP)와 diclofenac (DF)와 같은 비 steroidal 항염증성 약물 (NSAIDs)에 대한 과민성 반응은 알레르기 반응 하나 I – 같은 유형 매니 페스트 수 있습니다. 피부 테스트는 신뢰성이되지 않고 구두 도발 시험은 환자 2 생명을 위협하는 위험을 저승으로 임상 연습에서 약물 과민성의 진단은 주로 환자의 역사에 의해 수행됩니다. 따라서, 기본 IGE – 중재 pathomechanism에 대한 증거는 얻을 수 어렵습니다.
여기, 우리는 생체내에 알레르기 반응을 모방 이펙터 약물 과민 환자에서 파생된 인간 basophils의 사용에 따라 체외 방식에 제시. 약물 알레르기 환자의 basophils는 범인의 약물에 대한 IGE 분자가 특정 휴대으로, 그들은 IGE 수용체 crosslinking에 활성화되고 알레르기 이펙터 분자를 릴리스된다. basophils의 활성화는 유동세포계측법 3을 사용 CD63 표면 표현의 upregulation의 결정에 의해 모니터할 수 있습니다.
낮은 분자량의 약물의 경우, conjugates은 basophils에서 IGE 수용체 crosslinking을 사용하도록 설계되었습니다. 그림 1, NSAIDs의 두 대표에 묘사된, PP와 DF는 covalently 리신 잔류물의 기본 아미노 그룹과 반응 카르 복실 그룹을 통해 (HSA) 인간 혈청 알부민에 바인딩됩니다. 카르 복실 그룹이 포함된 PP의 파생은 organochemically 사전 연구 1 합성이 분명해 반면, DF는, 따라서 직접 사 사용할 수있는 고유 카르 복실 그룹과를 수행합니다.
단백질 캐리어 분자에서 낮은 분자량 화합물과 그 공간적 분포의 결합 정도는 두 IGE 수용체 분자의 crosslinking을 보장하는 것이 중요합니다. 여기에서 설명한 프로토콜은 순차적 굴절률 (RI)와 울트라 바이올렛 (UV) 커플링 학위 결정에 대한 감지 시스템이 장착된 고성능 크기 제외 크로마 토그래피 (HPSEC)을 적용합니다.
설명 방법론이 다른 약물에 대해 적용될 수 있습니다으로서, basophil 인증 시험 (BAT)는 약물 과민성의 IGE – 중재 메커니즘의 결정에 사용될 수있는 잠재력을 맺는다. 여기, 우리는 IGE – 중재와 DF의 과민성 BAT에 의해 비 IGE – 중재만큼 PP 과민성을 결정합니다.
BAT는 잘 설립된 아직 정기적으로 IGE – 중재 알레르기 질환 6,7의 진단 방법을 사용하지만. 낮은 분자량 화합물이 crosslink IGE 수용체, basophil 활성화 8 필수 수 없습니다와 같은 약물에 대한 과민성, 그러나, 그 적용 손실이 크다. 따라서, 조사중인 의약품 covalently 적합한 캐리어 단백질 (예 : HSA)에 결합해야합니다. 중요한 것은, 커플링 학위 (캐리어 단백질마다 약물 분자 즉, 숫자) conjugates의 (예 : IGE 수용체 상호 연결) 면역 활동을 보장하기 위해 제어해야합니다. 이론적으로, 캐리어 분자 당 두 haptens는 IGE 수용체에 대한 충분해야 교차 연결 및 HSA 당 다섯 DF 분자처럼 몇 가지는 세포 기반 분석 4 중재자 릴리스를 실행하는 표시되었습니다. 두 conjugates, PP – HSA 및 DF – HSA는 충분히 높은 커플링 학위 (HPSEC)을 표시하고 BAT에서 사용하기에 적합 시약 만들기 immunologically 적극적인 것으로 결정되었습니다. 또 다른 문제는 대신 부모 약물의 대사로 과민성 반응을 일으킬 수, 마약 metabolites는 역할을 수 있습니다. DF의 경우,이 가능성은 이전에 5 개의 주요 단계 전 metabolites 하나의 결합의 변형 4를 사용하여 상세하게 평가되었습니다. 마스터 설명한 기법을위한 중요한 요소는 혈액 샘플 (<혈액 수집, 검색 basophils의 수를 이후 12시간> 500)와 자극 조건 최적화 (시간, 투약)의 품질을 포함합니다. 또한,도 긍정적인 컨트롤 (항체는 IGE 수용체에 대한 감독) 식별해야 할과 반응하지 않은 조치를 소위. 따라서, 검증 기준은 긍정적인 제어로 안티 FcεRI 항체를 포함해야합니다. 약물 conjugates를 사용하는 중요한 이점은 그들은 마치 BAT 4 반 FcεRI 항체와 공동 자극에 의해 DF – HSA 활용에 표시되는 순수한 약물과는 달리 무독성 표시는 사실이다. 순수 DF는 반면, BAT 9 interpretability 문제를 일으키는 1.25 MG / ML의 농도에서 세포 독성 효과를 표시합니다. 일반적으로, 잠재적인 세포 독성에 대한 테스트를 강력하게 모든 새로 생산된 마약을 활용하는 것이 좋습니다.
여기, 우리는 IGE – 중재 과민성을 나타내기 위해 BAT에 사용되는 PP – HSA 활용의 잠재력을 보여주었다. 대조적으로, DF 과민성는 DF – HSA 활용에 대한 응답으로 basophil 활성화의 부족에 의해 입증 IGE와 관련되지 않습니다. 중요한 것은 IGE – 중재 메커니즘에 관한 불확실성의 경우, conjugates는 DF 4 보여왔다로 체외 세포 기반 분석 시스템에 의해 면역 활동을 평가해야합니다.
적당한 단백질 회사에 covalently 낮은 분자량의 약물을 결합의 설명 설정을 사용하면 항생제를 포함한 약물, 다른 NSAIDs, radiocontrast 미디어, 근육 relaxants, anesthetics에 대한 과민성 반응의 숫자를 분자 등 IGE – 중재의 참여에 대한 조사 수 있습니다 메커니즘. 따라서, BAT는 진단 (피부 반응 검사, 구강 도발 테스트)에 대한 기존 방법에 추가 될 수있다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 오스트리아 과학 기금 (FWF) 부여 P18820 – B13에 의해 투자되었다.
윤리 성명 :
연구는 1983 년에 개정하여 참여 모든 환자들이 서면 동의 준 정보로 헬싱키 Declaraction 준수 잘츠부르크 대학에서 인간 및 / 또는 동물에 관련된 실험 윤리위원회 (PLUS_Ethik_090514) 승인되었습니다.
Name of the reagent/device | Company | Catalogue number | Comments |
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2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid | Sigma | M3671 | – |
7.8 x 300 mm TSK Gel -G2000SWXL column | Tosoh Bioscience | 08540 | – |
BD FACSCanto II | Becton Dickinson | 338962 | – |
Bench top centrifuge | Sigma | – | – |
Diclofenac sodium salt | Sigma | D6899 | – |
EDTA-Vacutainer | Becton Dickinson | 368589 | – |
Flow2 CAST Kit | Bühlmann Laboratories | FK-CCR | Effective June 14, 2011 Flow2 CAST kit is now Flow CAST |
HP1100 HPLC system | Hewlett Packard | – | – |
Human Serum Albumin | Sigma | A9511 | – |
Laboratory centrifuge | Eppendorf | – | – |
N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma | E6383 | – |
PBS tablets | AppliChem | A9199 | – |
Propyphenazone derivative | Department of Molecular Biology, University of Salzburg, Austria | – | – |
Shaker | Eppendorf | – | – |
Sodium azide | Sigma | S8032 | – |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S1679 | – |
Sodium hydrogen carbonate | Sigma | 90421C | – |
Sodium hydroxid | Sigma | S5881 | – |
Sodium phosphate | Sigma | 342483 | – |
Triple detector array | Viscotek | TDA302 | – |
Personal BioVortex V-1 plus | Peqlab | 90-V-1 | – |
Water bath 1012 | GFL | 1012 | – |