嗜碱性粒细胞活化试验是一种IgE依赖的过敏检测的有力工具<em>在体外</em>。在这里,嗜碱性粒细胞活化试验的优化协议是用来研究药物过敏。一种高效的生产药物蛋白的共价结合物及其理化性质的方法是描述。
对像propyphenazone(PP)和双氯芬酸(DF)的非甾体抗炎药(NSAIDs)的过敏反应可表现为I型样过敏反应 1 。在临床实践中,对药物过敏的诊断主要是由患者的病史,皮肤测试是不可靠的和口头挑衅测试熊生命危险, 为病人2的。因此,一个潜在的IgE介导的病理机制证据是很难获得。
在这里,我们目前的基础上,使用药物过敏的患者,可以模仿在体内的效应反应过敏的人类嗜碱性粒细胞的体外培养方法。由于药物过敏的患者嗜碱性粒细胞进行特定的IgE分子的罪魁祸首药物,他们被激活后IgE受体交联,释放过敏效应分子。嗜碱性粒细胞的活化,可以监视通过上调CD63的表面表达用流式细胞仪检测3测定。
在低分子量药物的情况下,共轭旨在使嗜碱性粒细胞上的IgE受体的交联。正如在图1中 ,非甾体抗炎药的两名代表所示,PP和DF,共价结合,通过与主赖氨酸残基的氨基酸组的羧基反应组的人血清白蛋白( HSA)的。东风带有一种内在的羧基,因此,可以直接使用 4,而含羧基衍生的PP organochemically合成前研究 1 。
耦合度低分子量蛋白质载体分子化合物及其空间分布,重要的是要保证两个IgE受体分子的交联。这里所描述的协议,适用于高性能尺寸排阻色谱(HPSEC)配备一个连续的折射率(RI)和紫外线(UV)检测系统的耦合度的决心。
由于描述的方法可应用于其他药物,嗜碱性粒细胞活化试验(BAT)熊潜力的IgE介导的机制的药物过敏的决心。在这里,我们确定IgE介导和DF英美烟草公司非IgE抗体介导的过敏PP的超敏反应。
英美烟草公司是一个良好的成立虽然尚未用于常规诊断IgE介导的过敏性疾病的6,7的方法。然而,药物过敏,其适用性受到损害为低分子化合物不能交联的IgE受体,嗜碱性粒细胞活化8的一个先决条件。因此,根据调查的药物,需要合适的载体蛋白质(如白蛋白)共价结合。重要的是,耦合度( 即每载体蛋白的药物分子的数量),需要加以控制,以保证免疫活性的结合物 (即IgE受体交联)。从理论上讲,载体分子,每两个半抗原应足以IgE受体交联,只有百分之五的人血清白蛋白的DF分子已被证明在基于单元的检测 4触发介质释放。两者结合物,PP – HSA和DF – HSA的,已被确定为显示足够高的耦合度(HPSEC),使他们在BAT合适的试剂,免疫积极。另一个问题可能是药物代谢物可能会起到一定的作用,而不是母体药物的代谢产物可能会引起过敏反应。在东风的情况下,这种可能性已经在以前使用的五个主要阶段我的代谢产物和联动变种4的详细评估。掌握所描述的技术重要因素包括血液样本(<12小时后采血,检测嗜碱性粒细胞数> 500)的质量和优化的刺激条件(时间,剂量)。此外,所谓的非应答,谁也不确定阳性对照(抗体IgE受体的指示)反应。因此,验证标准,包括抗FcεRI抗体为阳性对照。一个重要的优势是使用药物共轭的事实,他们出现在对比纯净的药品,作为DF – HSA的共轭抗FcεRI 英美烟草 4抗体协同刺激无毒。相比之下,纯东风,显示在浓度为1.25毫克/毫升的细胞毒作用,导致英美烟草 9解释性的问题。一般情况下,潜在的细胞毒性测试,强烈建议每一个新产生的药物共轭。
在这里,我们已经表明PP – HSA的结合物的潜力,在英美烟草公司用来揭示IgE介导的超敏反应。与此相反,DF过敏是不是与IgE的表现在缺乏嗜碱粒细胞的活化响应DF – HSA的共轭。重要的是,关于IgE介导的机制的不确定性的情况下,结合物的免疫活性,在体外细胞为基础的检测系统进行评估,已为东风4所示。
使用的描述设置合适的蛋白载体共价键的共轭低分子量药物分子对包括抗生素药,非甾体抗炎药,造影媒体,肌肉松弛剂,麻醉剂的过敏反应等,可进行调查的IgE介导的参与机制。因此,英美烟草公司可能会作为一个除了现有的方法进行诊断(皮试,口服激发试验)。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由奥地利科学基金会(FWF)授予P18820 – B13。
伦理声明:
这项研究是由伦理委员会批准(PLUS_Ethik_090514)在萨尔茨堡大学,涉及人类和/或动物实验与修订于1983年,所有患者参加了他们的书面知情同意遵守赫尔辛基Declaraction。
Name of the reagent/device | Company | Catalogue number | Comments |
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2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid | Sigma | M3671 | – |
7.8 x 300 mm TSK Gel -G2000SWXL column | Tosoh Bioscience | 08540 | – |
BD FACSCanto II | Becton Dickinson | 338962 | – |
Bench top centrifuge | Sigma | – | – |
Diclofenac sodium salt | Sigma | D6899 | – |
EDTA-Vacutainer | Becton Dickinson | 368589 | – |
Flow2 CAST Kit | Bühlmann Laboratories | FK-CCR | Effective June 14, 2011 Flow2 CAST kit is now Flow CAST |
HP1100 HPLC system | Hewlett Packard | – | – |
Human Serum Albumin | Sigma | A9511 | – |
Laboratory centrifuge | Eppendorf | – | – |
N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma | E6383 | – |
PBS tablets | AppliChem | A9199 | – |
Propyphenazone derivative | Department of Molecular Biology, University of Salzburg, Austria | – | – |
Shaker | Eppendorf | – | – |
Sodium azide | Sigma | S8032 | – |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S1679 | – |
Sodium hydrogen carbonate | Sigma | 90421C | – |
Sodium hydroxid | Sigma | S5881 | – |
Sodium phosphate | Sigma | 342483 | – |
Triple detector array | Viscotek | TDA302 | – |
Personal BioVortex V-1 plus | Peqlab | 90-V-1 | – |
Water bath 1012 | GFL | 1012 | – |