تلوث استعدادات حقيقية النواة ريبوسوم تنقيته بواسطة الطرق التقليدية التي شاركت في تنقية nucleases البروتياز ويؤثر سلبا على مجرى النهر التحاليل البيوكيميائية والهيكلية. ويتم استخدام أسلوب بسيط وسريع لتنقية الكروماتوغرافي لحل هذه المشكلة باستخدام الخميرة ريبوسوم كنظام النموذج.
ريبوسوم حقيقية النواة هي أكثر عطوب بالمقارنة مع نظرائهم eubacterial وarchael ، مما يشكل تحديا كبيرا للباحثين. مزعجا بشكل خاص هو حقيقة أن تحلل الخلايا النشرات عددا كبيرا من البروتياز وnucleases التي يمكن أن تتحلل ريبوسوم. وبالتالي ، فمن المهم لفصل ريبوسوم من هذه الإنزيمات في أسرع وقت ممكن. للأسف ، الطرق التقليدية تنبيذ فائق الفرق ريبوسوم يترك عرضة لهذه الانزيمات لفترات طويلة من الزمن بشكل غير مقبول ، مما يؤثر على سلامتها الهيكلية والوظيفية. لمعالجة هذه المشكلة ، ونحن استخدام أسلوب الكروماتوغرافي باستخدام السيستين اتهم Sulfolink الراتنج. هذا التطبيق بسيطة وسريعة يقلل بشكل ملحوظ شارك في أنشطة تنقية وnucleolytic بروتين ، وتنتج غلة عالية من سليمة ، ريبوسوم الخميرة النشطة كيميائيا للغاية. نقترح أن هذا الأسلوب يجب أن ينطبق أيضا على ريبوسوم الثدييات. بساطةالأسلوب ، والنقاء ، وتعزيز نشاط الريبوسوم المنقى chromatographically يمثل تقدما كبيرا التقنية لدراسة ريبوسوم حقيقية النواة.
بروتوكولات أساسية تشمل تنقية الريبوسوم الخلايا lysing وحصاد جزء من عصاري خلوي تدور بسرعة منخفضة ، والتكوير ثم ريبوسوم بواسطة الطرد المركزي بسرعة عالية 1. في حين تم استخدام أساليب الرواية قليلة لتنقية ريبوسوم البكتيرية ، وكان نفس لم ينطبق على حقيقيات النوى 2-4.</su…
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر جميع أعضاء المختبر Dinman ، بما في ذلك Belew أشتون ، جاك كارين ، Musalga Sharmishtha ، Sulima سيرجي ريدي شيفاني ، ومايكل Rhodin لما قدموه من مساعدة والمساهمة في هذا المشروع. وأيد هذا العمل عن طريق منح لصباحا من جمعية القلب الأمريكية (AHA 0630163N) وJDD من المعاهد الوطنية للصحة (5R01 GM058859 – 12). وأيد جال قبل إعادة الاستثمار الأميركي وقانون الانتعاش عام 2009 تكملة لمنح الأم (3R01GM058859 – 11S1).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Sulfolink Coupling resin | Pierce | 20402 |
Mini bead-beater 16 | Biospec | 607 |
Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter | |
Legend RT | Sorvall | |
0.5 mm Glass beads | Biospec | 11079105 |
Tris | Sigma-Aldrich | 252859 |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 |
DTT | Sigma-Aldrich | 43815 |
HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
KCl | Sigma-Aldrich | 60128 |
Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 |
KOH | Sigma-Aldrich | 221473 |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 |
GTP | Fermentas | R0461 |