Summary

Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

Published: July 22, 2011
doi:

Summary

Tregs son supresores potentes del sistema inmune. Hay una falta de marcadores de superficie única para definir, por lo tanto, las definiciones de células T reguladoras son principalmente funcionales. A continuación se describe un optimizado<em> In vitro</em> Prueba capaz de identificar el desequilibrio inmunológico en personas en riesgo de desarrollar DT1.

Abstract

Las células T reguladoras (Tregs) son mediadores críticos de la tolerancia inmunológica a antígenos propios. Además, son reguladores esenciales de la respuesta inmune después de una infección. A pesar de los esfuerzos para identificar marcadores de superficie única en Tregs, la única característica única es su capacidad para suprimir la proliferación y la función de las células T efectoras. Si bien es claro que sólo en los ensayos in vitro se pueden utilizar en la evaluación de la función Treg humanos, esto se vuelve problemático cuando se evalúen los resultados de los estudios transversales en las células sanas y células aisladas de pacientes con enfermedades autoinmunes (como la diabetes tipo 1-DT1) necesitan para ser comparados. Hay una gran variabilidad entre laboratorios en el número y tipo de células T de respuesta, la naturaleza y la fuerza de la estimulación, Treg: ratios de respuesta y el número y tipo de células presentadoras de antígeno (APC) que se utiliza en humanos en ensayos de supresión in vitro. Esta variabilidad hace que la comparación entre los estudios de medición de la función Treg difícil. El campo de las necesidades de Treg un ensayo de supresión estándar que funcione bien con los sujetos sanos y aquellos con enfermedades autoinmunes. Hemos desarrollado un ensayo de supresión in vitro que muestran muy poca variabilidad intra-ensayo en la estimulación de células T aisladas de voluntarios sanos en comparación con sujetos con base destrucción autoinmune de las células pancreáticas β-. El objetivo principal de esta obra es describir un ensayo in vitro supresión humanos que permita la comparación entre grupos de sujetos diferentes. Además, este ensayo tiene el potencial para delinear una pequeña pérdida en la función nTreg y anticiparse a una mayor pérdida en el futuro, por lo tanto la identificación de los sujetos que podrían beneficiarse de la terapia inmunomoduladora preventivas 1. A continuación, ofrecemos una descripción detallada de los pasos involucrados en este procedimiento. Esperamos contribuir a la estandarización de la prueba de supresión in vitro utilizado para medir la función Treg. Además, le ofrecemos este ensayo como una herramienta para reconocer un estado inicial de desequilibrio inmunológico y un biomarcador potencial funcional de DT1.

Protocol

1. Antes de la creación de un ensayo de supresión, es necesario cuentas de abrigo tosylactivated con anti-CD3 humano (clon UCHT1, 1μg/ml concentración final) para la estimulación de células y después comprobar si las cuentas están recubiertas de manera eficiente mediante la creación de un ensayo in vitro de la proliferación de uso humano las células T Tomar 1 ml de M-450 cuentas de tosylactivated vial original, lugar en soporte magnético y espera hasta que todas las cuentas se han adherid…

Discussion

Como la única característica única de células T reguladoras, la función de supresión debe ser probado de forma fiable y uniforme entre los sujetos en las diferentes fases de desarrollo de la enfermedad dentro de la misma y entre los diferentes estudios. Le ofrecemos los detalles de la prueba de supresión desarrollado en nuestro laboratorio como nuestra contribución a la normalización de este ensayo. En nuestro estudio de optimización extensa, hemos determinado que la estimulación de células T con anti-CD3 hu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue apoyado por Max McGee Centro Nacional de Investigación para Menores Diabetesat Colegio Médico de Wisconsin y el Instituto de Investigación de Niños de Wisconsin. Los financiadores no participó en el diseño del estudio, la recopilación de datos y análisis, o la preparación del manuscrito.

Materials

Name of the reagent or instrument Company Catalogue number Comments (optional)
Ficoll-Paque PLUS Amersham Pharmacia Biotech 17-1440-03  
DPBS-1X Gibco 14190-144  
Trypan Blue Invitrogen 15250-061  
anti-CD4 microbeads Miltenyi 130-045-101  
Pre-separation filters Miltenyi 130-041-407  
LS column Miltenyi 130-042-401  
EDTA Invitrogen 15575-020  
BSA Sigma-Aldrich B4287  
Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) BD Pharmingen 557852  
Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) BD Pharmingen 555432  
Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) BD Pharmingen 555366  
Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) BD Pharmingen 555397  
Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) BD Pharmingen 555448  
Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chain) BD Pharmingen 554532  
Dynalbeads M-450 tosylactivated Invitrogen 140-13  
Anti-human CD3 Ancell 144-024  
Buffer1 Homemade   0.1M Na2B4O7 pH7.6
Buffer2 Homemade   PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4
Buffer3 Homemade   0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5
Complete RPMI media Homemade   RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate
[3H] thymidine Perkin Elmer NET027Z005MC  
human pooled AB serum Atlanta Biologicals S40110  
Multiscreen harvest plate Millipore MAHFC1H60  
Microscint 20 Perkin Elmer 6013621  

References

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Cite This Article
Waukau, J., Woodliff, J., Glisic, S. Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance. J. Vis. Exp. (53), e3071, doi:10.3791/3071 (2011).

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