Summary

Umano In Vitro come strumento di screening per il riconoscimento di uno Stato precoce di squilibrio immunitario

Published: July 22, 2011
doi:

Summary

Tregs sono potenti soppressori del sistema immunitario. Vi è una mancanza di marcatori di superficie unica per definire loro, quindi, le definizioni di Tregs sono soprattutto funzionali. Qui descrivere un ottimizzato<em> In vitro</em> Test in grado di identificare squilibrio immunitario nei soggetti a rischio di sviluppare diabete di tipo 1.

Abstract

Cellule T regolatorie (Tregs) sono mediatori critici della tolleranza immunitaria di auto-antigeni. Inoltre, essi sono regolatori cruciali della risposta immunitaria in seguito ad un infezione. Nonostante gli sforzi per identificare marcatori unica superficie sulla Tregs, l'unica caratteristica unica è la loro capacità di sopprimere la proliferazione e la funzione delle cellule T effettrici. Mentre è chiaro che solo saggi in vitro possono essere utilizzati nella valutazione funzione umana Treg, questo diventa problematica in sede di valutazione dei risultati di studi trasversali in cui le cellule sane e cellule isolate da pazienti con malattie autoimmuni (come il diabete di tipo 1, diabete di tipo 1) è necessario da confrontare. C'è una grande variabilità tra i laboratori del numero e del tipo di risponditore cellule T, la natura e la forza della stimolazione, Treg: rapporti responder e il numero e il tipo di cellule presentanti l'antigene (APC) utilizzati in test di soppressione umani in vitro. Questa variabilità rende il confronto tra studi di misurazione funzione Treg difficile. Il campo Treg ha bisogno di un test standardizzato di soppressione che funzionano bene con entrambi i soggetti sani e quelli con malattie autoimmuni. Abbiamo sviluppato un test in vitro di soppressione che mostra poca variabilità intra-saggio nella stimolazione delle cellule T isolate da volontari sani rispetto ai soggetti con sottostante distruzione autoimmune delle cellule β pancreatiche. L'obiettivo principale di questo pezzo è quello di descrivere un test di soppressione umani in vitro che permette il confronto tra gruppi di soggetti diversi. Inoltre, questo saggio ha il potenziale per delineare una piccola perdita in nTreg funzione e anticipare ulteriormente la perdita per il futuro, individuando così i soggetti che potrebbero trarre beneficio dalla terapia immunomodulante preventiva 1. Di seguito, forniamo la descrizione accurata delle fasi di questa procedura. Speriamo di contribuire alla standardizzazione dei test in vitro soppressione utilizzato per misurare la funzione Treg. Inoltre, offriamo questa analisi come strumento per riconoscere uno stato iniziale di squilibrio immunitario e un potenziale biomarcatore funzionale per diabete di tipo 1.

Protocol

1. Prima di impostare un test di soppressione, si ha la necessità di perline cappotto tosylactivated con anti-CD3 umano (clone UCHT1, 1μg/ml concentrazione finale) per la stimolazione delle cellule e poi verificare se le perle sono rivestiti in modo efficiente attraverso la creazione di un test in vitro proliferazione utilizzando umano cellule T Prendere 1 ml di M-450 perle tosylactivated dal flacone originale, mettere in stand magnetici e tenere premuto fino a quando tutte le perle hanno aderito a…

Discussion

Essendo l'unica caratteristica unica di Tregs, la funzione di soppressione dovrebbero essere testati in modo affidabile e uniformemente tra soggetti nelle diverse fasi di sviluppo della malattia all'interno della stessa e tra studi differenti. Offriamo i dettagli del test di soppressione sviluppato nel nostro laboratorio come il nostro contributo alla standardizzazione di questo test. Nel nostro studio di ottimizzazione ampio, abbiamo determinato che la stimolazione delle cellule T con anti-CD3 umano rivestite p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato supportato da Max McGee Nazionale delle Ricerche Centro Giovanile Diabetesat Medical College del Wisconsin e bambini Research Institute of Wisconsin. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta el'analisi dei dati, o la preparazione del manoscritto.

Materials

Name of the reagent or instrument Company Catalogue number Comments (optional)
Ficoll-Paque PLUS Amersham Pharmacia Biotech 17-1440-03  
DPBS-1X Gibco 14190-144  
Trypan Blue Invitrogen 15250-061  
anti-CD4 microbeads Miltenyi 130-045-101  
Pre-separation filters Miltenyi 130-041-407  
LS column Miltenyi 130-042-401  
EDTA Invitrogen 15575-020  
BSA Sigma-Aldrich B4287  
Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) BD Pharmingen 557852  
Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) BD Pharmingen 555432  
Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) BD Pharmingen 555366  
Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) BD Pharmingen 555397  
Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) BD Pharmingen 555448  
Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chain) BD Pharmingen 554532  
Dynalbeads M-450 tosylactivated Invitrogen 140-13  
Anti-human CD3 Ancell 144-024  
Buffer1 Homemade   0.1M Na2B4O7 pH7.6
Buffer2 Homemade   PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4
Buffer3 Homemade   0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5
Complete RPMI media Homemade   RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate
[3H] thymidine Perkin Elmer NET027Z005MC  
human pooled AB serum Atlanta Biologicals S40110  
Multiscreen harvest plate Millipore MAHFC1H60  
Microscint 20 Perkin Elmer 6013621  

References

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Cite This Article
Waukau, J., Woodliff, J., Glisic, S. Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance. J. Vis. Exp. (53), e3071, doi:10.3791/3071 (2011).

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