Bu protokol, lenf nodu dilimler halinde sunulan görüntü floresan T hücreleri için bir yöntem açıklanır. Bu teknik, geleneksel widefield floresan veya konfokal mikroskoplar ile T hücre göç gerçek zamanlı analiz izin verir.
Nadir ifade antijenleri tespit etmek için periferik lenf düğümleri de dahil olmak üzere ikincil lenfoid organlara, naif T hücrelerinin sürekli trafik. T hücrelerinin lenf düğümleri içine göç kemokinler de dahil olmak üzere hem hücresel ve kimyasal faktörleri içeren karmaşık bir süreç. Son zamanlarda, iki foton mikroskopi sağlam lenf düğümleri T hücreleri izlemek için kendi davranış ve etkileşimleri ve diğer hücreleri ile bazı sayısal bilgiler elde etmek için izin verdi. In vivo sistemde bir açık avantajları olmakla birlikte, bu yaklaşım, karmaşık ve pahalı aletlerle gerektirir ve doku sınırlı erişim sağlar. Fare lenf düğümleri içinde T hücrelerinin davranışını analiz etmek, bir dilim testi 1, başlangıçta neurobiologists tarafından kurulan ve son zamanlarda fare timus 2 aktarılmamıştır geliştirdik. Bu teknikte, floresan etiketli T hücreleri, akut hazırlanan bir lenf nodu dilim üst kaplamadır. Bu video-makale, T hücrelerinin doku içine yerelleştirme ve göç widefield ve konfokal mikroskop ile gerçek zamanlı olarak analiz edilmektedir. In vivo olarak iki foton mikroskopi doğal ortamda görüntü T hücreleri etkili bir yaklaşım sunuyor ve T hücre göçün altında yatan mekanizmaları aydınlatmak için tamamlar tekniği.
Biz tanıtıldı T hücrelerinin davranışı araştırmak için kullanılır lenf nodu dilimleri, üretmek için basit, hızlı ve sağlam bir teknik tanımlanmıştır. Son yıllarda, bu yöntem başarılı bir şekilde kontrol eden T hücre konumlandırma ve motilite 1,5 ekstrasellüler faktörleri belirlemek için timus ve lenf nodu dilimleri kullanarak tatbik edilmiştir. Aynı zamanda pozitif seçim sırasında ve sonra T hücrelerinin antijen tanıma 2,6 timositleri Ca 2 + tepkileri ölçmek için kullanılır olmuştur. Bindirme dilim tahlil avantajları ve sınırlamalar ele alınacak hak sunar. Notu, bu sistemin moleküler hücre göç kontrolü ile müdahale edebilmek için bir ihtiyacı farmakolojik dilimleri işlemek için faydalı, doku erişim izni verir. Görüntülemeye sonra dilimleri görüntülü edilmiş yapılar hakkında daha fazla bilgi toplamak için immünohistokimya için işlenmiş olabilir. Ayrıca, gözlem, geleneksel bir widefield floresan mikroskobu ile yapılabilir. Çözünürlük konfokal veya iki foton bir mikroskop gibi iyi değil ve bu fototoksisite prensip olarak iki foton mikroskobu ile daha tek foton ile daha şiddetli olmasına rağmen, bu basitlik avantajlarını, daha düşük bir maliyetle ve daha büyük bir seçim var eksitasyon dalga boylarında.
T hücreleri sağlam bir lenf nodu görüntüleme etiketli lenfositlerin intravenöz enjeksiyon gerektirir lenfoid organlara daha sonra ev. Biz daha önce 1 gösterdiği gibi, dilim tahlil, evlat edinen transferi deney ile mükemmel uyumlu . Ancak, T hücreleri lenf düğümleri içine ev için gerekli sürenin uzunluğu zamanla hücrelerin dışarı akması için bir eğilim var floresan boyaların kullanımı karmaşık hale getirebilir. Bu durumda Ca 2 + boya Fura-2. T hücrelerinin doku içine hızlı işe (<30 dk), dilim testi bu tür boyalar kullanmak için bir fırsat sağlar. Son olarak, bu yöntem, birçok insan dokularında T hücre fonksiyonlarını analiz için büyük bir avantaj yaşatılıyor.
Bu deneysel sistemi de göz önünde bulundurulması gereken kısıtlamalar sunar. Dilimleme ile ilişkili hasarlar, özellikle kesme yüzeyine yakın doku yüzeysel bir bölgede, T hücre işleyişini etkileyebilir. Dilim içinde hücre ölümünü değerlendirmek amacıyla, floresan boya SYTOX yeşil tehlikeye plazma zarı ile hücre nüfuz kullanmıştır. Deneyler, çoğunlukla yüzeysel doku bölgede lokalize toplam düğüm hücreleri, yaklaşık% 20 bu nükleer boya ile floresan etiketli olduğunu ortaya koymaktadır. Testi ile diğer potansiyel endişe kemokinler de dahil olmak üzere önemli çözünür faktörler korumak için dilim yeteneğidir. T hücreleri dilim içinde iyi bir motilite ekran yılından beri bu tür sorunlar etkilendiğini herhangi bir gösterge olsa da, biz görüntüleme T hücrelerinin sağlıklı bölgelerde kesim yüzeyi mikron onlarca bulunan önemini vurgulamak istiyorum. Bu protokolde gibi geleneksel mikroskoplar (widefield veya konfokal) ile yapılabilir Oysa, bu iki foton görüntüleme derinlemesine uzaysal çözünürlüğü artırmak ve fototoksisite azaltacaktır ile birlikte lenf nodu dilim hazırlık muhtemeldir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, bize lenf nodu dilim gerçekleştirmek için teşvik Dr. Alain Trautmann'ın teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Ligue Nationale Contre le Kanser, Fondation pour la Recherche medicale en France ve Ortaklık pour la recherche sur le Kanser hibe kısmen desteklenmiştir.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Confocal microscope | Leica | SP5 | |
Vibratome | Leica | VT1200S | |
Fine Forceps | World Precision Instruments | 14142 | |
30 mm Culture inserts | Millipore | PICM0RG50 | |
RPMI | Invitrogen | 61870010 | Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin |
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170088 | |
Low gelling temperature Agarose, type VII-A | Sigma-Aldrich | A0701 | |
Butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond | 3M | 1469 | |
Stainless steel washers, 4 mm of inner diameter | DIY store | ||
Cell Tracker green CMFDA | Invitrogen | C7025 |