פרוטוקול זה מתאר שיטה פלורסנט התמונה בתאי T הציג לפרוסות הלימפה. הטכניקה אישורים בזמן אמת וניתוחים של נדידת תאים T עם מסורתי widefield פלואורסצנטי או מיקרוסקופים confocal.
בתאי T נאיבי ברציפות תנועה הלימפה לאיברים משניים, כולל בלוטות הלימפה ההיקפית, כדי לזהות אנטיגנים הביע נדיר. ההגירה של תאים T לתוך בלוטות הלימפה היא תהליך מורכב אשר כולל שני גורמים הסלולר כימיים כולל chemokines. לאחרונה, השימוש במיקרוסקופ שני הפוטונים אפשרה לעקוב אחר בתאי T בבלוטות הלימפה שלם כדי להפיק כמה מידע כמותי על התנהגותם ויחסי הגומלין שלהם עם תאים אחרים. אמנם יש יתרונות ברורים על מערכת vivo, גישה זו דורשת מכשור מורכב ויקר ומספק גישה מוגבלת לרקמה. כדי לנתח את התנהגותם של תאים T בתוך בלוטות הלימפה Murine, פיתחנו assay פרוסה 1, שהוקם במקורו על ידי neurobiologists ואת משורבב לאחרונה התימוס Murine 2. בטכניקה זו, ותאי T שכותרתו fluorescently הם מצופה על גבי פרוסת מוכן בחריפות הלימפה. במאמר זה וידאו, לוקליזציה והגירה של תאים T לרקמת מנותחים בזמן אמת עם widefield ו מיקרוסקופ confocal. הטכניקה אשר משלים in vivo שני הפוטונים מיקרוסקופיה מציע גישה יעילה לתאי T תמונה בסביבתם הטבעית וכדי להבהיר המנגנונים הגירה T התא.
תיארנו טכניקה פשוטה, מהירה וחזקה להפקת הלימפה פרוסות, המשמשים כדי לחקור את התנהגותם של תאים T הציג. בשנים האחרונות, שיטה זו יושמה בהצלחה באמצעות הרתי ואת הצומת פרוסות הלימפה כדי לזהות את הגורמים תאיים השליטה מיצוב תא T ו תנועתיות 1,5. הוכח גם למדידת Ca 2 + תגובות thymocytes במהלך בחירת חיוביים בתאי T על ההכרה אנטיגן 2,6. Assay פרוסה כיסוי מציגה יתרונות ומגבלות שראוי לדון בו. ראוי לציין, מערכת זו מאפשר גישה לרקמה, שימושי אם צריך לתמרן פרוסות פרמקולוגית כדי להפריע לשליטה המולקולרי של נדידת תאים. לאחר הדמיה, הפרוסות יכול להיות מעובד על אימונוהיסטוכימיה לאסוף מידע נוסף על מבנים שכבר צילמו. יתר על כן, תצפית יכולה להתבצע באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי widefield המסורתית. למרות ההחלטה הוא לא טוב כמו עם confocal או מיקרוסקופ שני הפוטונים ו phototoxicity כי הוא עקרונית חמורה יותר עם פוטון אחד מאשר עם מיקרוסקופ שני הפוטונים, יש לו את היתרונות של פשטות, עלות נמוכה יותר, ובחירה גדולה יותר של אורכי גל עירור.
הדמיה של תאים T בתוך הצומת לימפה שלם דורש הזרקה תוך ורידית של לימפוציטים שכותרתו כי בית לאחר מכן הלימפה לאיברים. כפי שהראינו לעיל 1, assay פרוסה תואם לחלוטין עם בניסוי העברת המאמצת. עם זאת, משך הזמן הדרוש בתאי T לבית אל בלוטות הלימפה יכול לסבך את השימוש של צבעי ניאון, כי יש נטייה לדלוף של התאים לאורך זמן. זהו המקרה של Ca 2 + צבע fura-2. עם גיוס מהיר (<30 דקות) של תאים T לתוך הרקמה, assay פרוסה מספקת הזדמנות להשתמש בצבעים כאלה. לבסוף, בשיטה זו יש יתרון גדול לנתח פונקציות תא T ברקמות אנושיות מספר לשמר אותם.
מערכת זו מציגה את הניסוי גם מגבלות שצריך לזכור. נזק הקשורים חיתוך עשוי להשפיע על תפקוד תא T, במיוחד באזור שטחית של הרקמה קרוב לפני השטח לחתוך. על מנת להעריך מוות של תאים בתוך הפרוסה, השתמשנו צבע ירוק ניאון SYTOX החודרת תאים עם הממברנה הפלסמטית בסכנה. הניסויים שלנו מראים כי כ -20% מכלל התאים קטרי, מקומי בעיקר באזור שטחית של הרקמה, היו שכותרתו fluorescently עם צבע זה גרעיני. דאגה נוספת עם פוטנציאל assay הוא היכולת של הפרוסות כדי לשמור על גורמים מסיסים החשובים כולל chemokines. אמנם, אין לנו שום אינדיקציה כי הנתונים שלנו הושפעו בעיות כאלה מאז בתאי T להציג תנועתיות טובה בתוך הפרוסה, ברצוננו להדגיש את החשיבות של תאים הדמיה T באזורים בריא הממוקם כמה עשרות מיקרונים מפני השטח לחתוך. לעומת זאת, ניתן לעשות זאת עם מיקרוסקופים המסורתית (widefield או confocal) כמו בפרוטוקול זה, סביר להניח כי הלימפה הכנה פרוסה בשילוב עם שני הפוטונים הדמיה יגדיל את ברזולוציה מרחבית לעומק ולהקטין את phototoxicity.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות ד"ר אלן Trautmann שעודד אותנו לבצע הצומת פרוסות הלימפה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של הלאומית Ligue Contre Le הסרטן, מגט לשפוך en la משוכלל ונדיר Médicale צרפת לשפוך האגודה למלחמה בסרטן la משוכלל ונדיר sur le.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Confocal microscope | Leica | SP5 | |
Vibratome | Leica | VT1200S | |
Fine Forceps | World Precision Instruments | 14142 | |
30 mm Culture inserts | Millipore | PICM0RG50 | |
RPMI | Invitrogen | 61870010 | Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin |
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170088 | |
Low gelling temperature Agarose, type VII-A | Sigma-Aldrich | A0701 | |
Butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond | 3M | 1469 | |
Stainless steel washers, 4 mm of inner diameter | DIY store | ||
Cell Tracker green CMFDA | Invitrogen | C7025 |