Summary

Выявление инфекционных Касперского с поля, собранные Комары от Vero Пробирной культуры клеток

Published: June 09, 2011
doi:

Summary

Мы опишем метод для обработки и экран полевых собраны комаров для разнообразия вирусов Веро анализа культуры клеток. Используя эту технику, мы обнаружили 9 различных вирусов из 4 семей в таксономических комаров, собранных в Коннектикуте.

Abstract

Комары передавать число различных вирусов, включая важных человеческих патогенов, таких как вирус Западного Нила, лихорадка денге вируса, и chickungunya вируса. Многие из этих вирусов активизировались в эндемичных диапазонов и расширена на новые территории, что требует эффективных программ надзора и контроля, чтобы реагировать на эти угрозы. Одна из стратегий для мониторинга вирусной активности включает в себя сбор большого количества комаров из эндемичных сайтов и их тестирования на вирусную инфекцию. В этой статье мы опишем, как в обращении, процесс, и экран полевых собраны комаров для инфекционного вируса от Vero анализа культуры клеток. Комары сортируются по расположению ловушку и видов, а сгруппированы в пулы содержащего ≤ 50 человек. Объединенные образцы гомогенизировали в буферном растворе с помощью миксера-мельница и водную фазу прививку на сливной Vero клеточных культурах (Clone E6). Клеточные культуры контролируются на цитопатический эффект от нескольких дней 3-7 после прививки и любые вирусы, выращенные в культуре клеток определяются соответствующие диагностические анализы. Используя такой подход, мы выделили 9 различных вирусов от комаров, собранных в Коннектикут, США, и среди них, 5 как известно, вызывают болезни человека. Три из них вирусы (вирус Западного Нила, вирус Потоси и Ла-Кроссе вируса) представляют собой новый рекорд для Северной Америки или регионе Новая Англия с 1999 года. Способность обнаруживать большое разнообразие вирусов имеет решающее значение для мониторинга, которые создали и вновь появляющихся вирусов в организме комара населения.

Protocol

1. Сортировка комаров и идентификации Следующие процедуры выполняются на открытом лабораторном столе в специальной уровня биобезопасности-2 (BSL-2) лаборатории персонала, обученного работать с живыми комарами. "Холодовой цепи" сохраняется на протяжении всей процедуры. О?…

Discussion

Vero клеточной культуре анализа служит эффективным методом для скрининга поле, собранные комаров для разнообразия вирусов. Это контрастирует с молекулярными методами, которые специально направлены один или несколько вирусов, представляющих интерес. Более того, мы обнаружили, что Веро ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы выражаем искреннюю благодарность важный вклад д-ра. Джон Андерсон, Эндрю Главная и Ширли Tirrell к настоящему исследованию. Эта работа была частично поддержана грантами от Центров по контролю и профилактике заболеваний (U50/CCU116806-01-1) и Министерство сельского хозяйства США (58-6615-1-218, CONH00768 и CONH00773).

Materials

Name of reagent/ equipment Company Catalog Number
Fetal bovine serum Gibco – Invitrogen 16140
Anti-biotic/mycotic Gibco – Invitrogen 15240
Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. Gibco – Invitrogen 25080
L-Glutamine 200mM 100x Gibco-Invitrogen 25030
Powdered minimal essential medium (MEM) Gibco – Invitrogen 11700
10X Dulbecco’s PBS Gibco – Invitrogen 14080
Trypsin-EDTA Gibco – Invitrogen 15400
Rabbit serum Gibco – Invitrogen 16120
Vero Cells (Clone E6) ATCC CRL-1586
Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 Falcon – Becton Dickinson 353112
Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 Falcon – Becton Dickinson 353108
Copper-coated BB’s, 4.5 mm Crosman 0767
Mixer Mill Retsch MM300
Isopack freezer racks Eppendorf 022510240

References

  1. Chosewood, L. C., Wilson, D. E. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2007).
  2. Anderson, J. F. Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper’s hawk in Connecticut. Science. 286, 2331-2333 (1999).
  3. Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut. J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).
  4. Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England. Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).
  5. Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003. Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).
  6. Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut. J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).
  7. Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors. Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).
  8. Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006. Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).
  9. Beaty, B. J., Calisher, C. H., Shope, R., Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. Chapter 11. Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. , 189-212 (1995).
  10. Karabatsos, N. . International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates. , (1985).
  11. Lanciotti, R. S. Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay. J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).
  12. Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays. J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).

Play Video

Cite This Article
Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Finan, S. L., Shepard, J. J., Thomas, M. C. Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay. J. Vis. Exp. (52), e2889, doi:10.3791/2889 (2011).

View Video