Summary

La détection de virus infectieux à partir terrain recueillies par les moustiques Assay culture cellulaire Vero

Published: June 09, 2011
doi:

Summary

Nous décrivons une méthode pour traiter et d'un écran moustiques récoltés sur le terrain pour une diversité des virus par un test de culture de cellules Vero. En employant cette technique, nous avons détecté 9 virus différents de 4 familles taxonomiques dans les moustiques collectés dans le Connecticut.

Abstract

Les moustiques transmettent un certain nombre de virus distincts, y compris d'importants agents pathogènes humains tels que le virus West Nile, virus de la dengue et le virus chickungunya. Beaucoup de ces virus se sont intensifiées dans leurs gammes endémiques et élargi à de nouveaux territoires, ce qui nécessite des programmes efficaces de surveillance et de contrôle pour répondre à ces menaces. Une stratégie pour surveiller l'activité des virus consiste à recueillir un grand nombre de moustiques à partir de sites endémiques et les tests d'infection virale. Dans cet article, nous décrivons comment manipuler, traiter, et d'un écran prélevés sur le terrain pour les moustiques virus infectieux par un test de culture cellulaire Vero. Les moustiques sont triés par emplacement des pièges et des espèces, et regroupés en pools contenant ≤ 50 individus. Pooled spécimens sont homogénéisés dans une solution saline tamponnée en utilisant un mélangeur-broyeur et la phase aqueuse est inoculé à des confluents des cultures de cellules Vero (Clone E6). Les cultures cellulaires sont surveillés pour effet cytopathique de jours 3-7 après l'inoculation des virus et des mises en culture cellulaire sont identifiés par les tests de diagnostic appropriés. En utilisant cette approche, nous avons isolé 9 virus différent de moustiques collectés dans le Connecticut, USA, et parmi eux, 5 sont connus pour causer la maladie humaine. Trois de ces virus (virus du Nil occidental, le virus de Potosi et La Crosse virus) représentent de nouveaux records pour l'Amérique du Nord ou la région de la Nouvelle-Angleterre depuis 1999. La capacité de détecter une grande diversité de virus est essentielle à la surveillance établis et les nouveaux virus émergents dans la population de moustiques.

Protocol

1. Le tri et l'identification des moustiques Les procédures suivantes sont effectuées sur un banc dans un laboratoire ouvert dédié biosécurité de niveau 2 (BSL-2) en laboratoire par du personnel qui sont formés pour travailler avec les moustiques vivent. Une "chaîne du froid» est maintenu pendant toute la procédure. Anesthetize vivent les moustiques adultes en plaçant sac de collecte de moustiques dans un congélateur -20 ° C pendant 5 minutes. Sac de collecte de transfert d&#39…

Discussion

Dosage de la culture de cellules Vero sert comme une méthode efficace pour les moustiques écran prélevés sur le terrain pour une diversité des virus. Cela contraste avec les méthodes moléculaires qui ciblent spécifiquement une ou quelques virus d'intérêt. Par ailleurs, nous avons constaté que Vero essai de culture de cellules est tout autant, sinon plus sensible que la RT-PCR 7 et nous fournit des isolats de virus qui sont stockés dans notre collection de référence pour de futures études. N…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à souligner la contribution importante des Drs. John Anderson, Andrew Main et Shirley Tirrell à cette étude. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du Centers for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) et le US Department of Agriculture (58-6615-1-218, CONH00768 et CONH00773).

Materials

Name of reagent/ equipment Company Catalog Number
Fetal bovine serum Gibco – Invitrogen 16140
Anti-biotic/mycotic Gibco – Invitrogen 15240
Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. Gibco – Invitrogen 25080
L-Glutamine 200mM 100x Gibco-Invitrogen 25030
Powdered minimal essential medium (MEM) Gibco – Invitrogen 11700
10X Dulbecco’s PBS Gibco – Invitrogen 14080
Trypsin-EDTA Gibco – Invitrogen 15400
Rabbit serum Gibco – Invitrogen 16120
Vero Cells (Clone E6) ATCC CRL-1586
Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 Falcon – Becton Dickinson 353112
Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 Falcon – Becton Dickinson 353108
Copper-coated BB’s, 4.5 mm Crosman 0767
Mixer Mill Retsch MM300
Isopack freezer racks Eppendorf 022510240

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Cite This Article
Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Finan, S. L., Shepard, J. J., Thomas, M. C. Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay. J. Vis. Exp. (52), e2889, doi:10.3791/2889 (2011).

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