Summary

Un protocollo per la raccolta e la colorazione ematociti concentrati dal Mosquito febbre gialla Aedes aegypti</em

Published: May 16, 2011
doi:

Summary

Un semplice ma accurato metodo per raccogliere e macchia ematociti concentrati zanzara è descritto. Il nostro metodo combina la semplicità di perfusione con la precisione delle tecniche di iniezione ad alta isolare i preparativi pulita di ematociti concentrati in Aedes zanzare. Questo metodo facilita la conoscenza di studi che richiedono i tipi di ematociti concentrati e la loro abbondanza.

Abstract

Le zanzare sono vettori di una serie di agenti patogeni che causano malattie come il virus della febbre gialla, malaria, parassiti e vermi filarial. Laboratori stanno studiando anti-patogeno componenti del sistema immunitario innato nella specie dei vettori di malattie, nella speranza di generare zanzare transgeniche che sono refrattari agli agenti patogeni quali 1, 2. Il sistema immunitario innato di zanzare è composto da diverse linee di difesa 3. Agenti patogeni che riescono a sfuggire alla barriera imposta dalla epitelio-allineata zanzara midgut 4 Inserire il emolinfa e di incontro ematociti concentrati in circolazione, importanti componenti cellulari che incapsulano e patogeni fagocitare 5, 6. I ricercatori non hanno trovato prove per i tessuti emopoietici in zanzare e fatti suggeriscono che il numero di ematociti concentrati è fissato a emergere per adulti e numeri può effettivamente diminuire con l'invecchiamento della zanzara 7. La capacità di raccogliere correttamente e identificare ematociti concentrati dagli insetti medicalmente importante è un passo essenziale per gli studi di immunità cellulare. Tuttavia, la dimensione piccola delle zanzare e il volume limitato di emolinfa rappresentano una sfida a raccogliere le cellule immunitarie.

Due metodi per la raccolta di ematociti concentrati zanzara comprendono espulsione di emolinfa da un taglio proboscide 8, e lo spostamento del volume (perfusione), in cui viene iniettato soluzione salina nella regione membranosa necklike tra la testa e torace (cioè, cervice) e la perfusione emolinfa viene raccolta da un'apertura strappato in una regione distale dell'addome 9, 10. Queste tecniche, tuttavia, sono limitate da basso recupero di ematociti concentrati e di possibile contaminazione da parte delle cellule di grasso corporeo, rispettivamente 11. Più recentemente un metodo denominato di iniezione ad alta / recupero di un migliore recupero immunocytes mediante l'uso di tamponi anticoagulanti, riducendo i livelli di contaminanti scale e tessuti interni 11. Anche se questo metodo permette un metodo migliorato di raccolta e di conservazione ematociti concentrati per la cultura primaria, che comporta un certo numero di iniezione e fasi di raccolta che non sono necessari se l'obiettivo a valle è quello di raccogliere, fissare e macchia ematociti concentrati per la diagnostica. Qui, dimostriamo il nostro metodo di raccolta emolinfa zanzara che unisce la semplicità di perfusione, utilizzando tamponi anticoagulante al posto della soluzione fisiologica, con la precisione delle tecniche di iniezione ad alta isolare i preparativi pulita di ematociti concentrati in Aedes zanzare.

Protocol

1. Preparazione in anticipo della raccolta hemocyte Preparare una soluzione diluente emolinfa che consiste di 60% di media Schneider, 10% di siero fetale bovino (FBS) e tampone citrato 30% (anticoagulante; 98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1,7 mM EDTA, 41 ml Acido citrico, pH 4,5) 11. Fai aliquote 1,0 ml che possono essere conservati a -20 ° C. Utilizzare ciascuna aliquota solo una volta (vedi Materiali). Preparare vetrini da microscopio in vetro (75 x 25 x 1 mm) segnando un 1 cm di diametro cerc…

Discussion

Il metodo di raccolta hemocyte qui descritto è stato modificato dai metodi precedentemente pubblicato e permette di isolare i preparativi pulita di ematociti concentrati da zanzare Aedes con meno passaggi. Mentre il nostro particolare interesse risiede nel caratterizzare popolazioni hemocyte in zanzare Aedes, crediamo che questa tecnica può essere applicata a gruppi di altre zanzare, dopo gli studi iniziali condotti per determinare il volume d'iniezione appropriate. Il nostro protocollo utilizza …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Autori desiderano ringraziare Frey John e Ben Peterson per l'allevamento di zanzare. Ringraziamo anche Christine Davis e Gary Radice per un aiuto con micrografie hemocyte. Questa ricerca è stata finanziata dalla University of Richmond Arte e Scienza di borsa di studio estiva AA Qayum e docenti concedere ad A. Telang.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Schneider’s Medium Sigma-Aldrich S0146  
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F0643  
Hema3 stain kit Fisher 123-869  
Glass needles
(borosilicate with filament)
Sutter Instrument BF100-78-10 1.0mm O.D. and 0.78mm I.D.
Needle puller Sutter Instruments Model P-87  
MicroInjector Tritech Research MINJ-PD  
Needle holder Tritech Research MINJ-4  

References

  1. Enayati, A., Hemingway, J. Malaria management: past, present, and future. Annu. Rev. Entomol. 55, 569-569 (2010).
  2. Medlock, J., Luz, P. M., Struchiner, C. J., Galvani, A. P. The impact of transgenic mosquitoes on dengue virulence to humans and mosquitoes. The American Naturalist. 174, 565-565 (2009).
  3. Baton, L. A., Garver, L., Xi, Z., Dimopoulos, G. Functional genomics studies on the innate immunity of disease vectors. Insect Sci. 15, 15-15 (2008).
  4. Thomas, R. E., Wu, W. K., Verleye, D., Rai, K. S. Midgut basal lamina thickness and dengue-1 virus dissemination rates in laboratory strains of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J. Med. Entomol. 30, 326-326 (1993).
  5. Bartholomay, L. C. Profiling infection responses in the haemocytes of the mosquito, Aedes aegypti. Insect Mol. Biol. 16, 761-761 (2007).
  6. Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15, 1-1 (2008).
  7. Hillyer, J. F. Age-associated mortality in immune challenged mosquitoes (Aedes aegypti) correlates with a decrease in haemocyte numbers. Cell. Microbiol. 7, 39-39 (2005).
  8. Chen, C. C., Laurence, B. R. In vitro study on humoral encapsulation of microfilariae: establishment of technique and description of reaction. International Journal for Parasitology. 17, 781-781 (1987).
  9. Beerntsen, B. T., Christensen, B. M. Dirofilaria immitis: effects on hemolymph polypeptide synthesis in Aedes aegypti during melanotic encapsulation reactions against Microfilariae. Exp. Parasitol. 71, 406-406 (1990).
  10. Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. The antibacterial innate immune response by the mosquito Aedes aegypti is mediated by hemocytes and independent of Gram type and pathogenicity. Microb. Infect. 6, 448-448 (2004).
  11. Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36, 891-891 (2006).

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Cite This Article
Qayum, A. A., Telang, A. A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (51), e2772, doi:10.3791/2772 (2011).

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