Summary

Un protocole pour le recueil et la coloration hémocytes du moustique Fièvre jaune Aedes aegypti</em

Published: May 16, 2011
doi:

Summary

Une méthode précise encore simplifiée pour collecter et tacher hémocytes de moustique est décrite. Notre méthode combine la simplicité de la perfusion avec la précision des techniques d'injection élevée pour isoler les préparatifs propre de hémocytes de moustiques du genre Aedes. Cette méthode facilite la connaissance des études nécessitant des types d'hémocytes et leur abondance.

Abstract

Les moustiques sont vecteurs d'un certain nombre d'agents pathogènes comme le virus de la fièvre jaune, les parasites du paludisme et de filaires. Les laboratoires sont enquêter anti-pathogènes des composants du système immunitaire inné des espèces vecteurs de maladies dans l'espoir de générer des moustiques transgéniques qui sont réfractaires aux agents pathogènes comme 1, 2. Le système immunitaire inné des moustiques se compose de plusieurs lignes de défense 3. Les pathogènes qui parviennent à échapper à la barrière imposée par le moustique épithélium bordée intestin 4 Entrez l'hémolymphe et de rencontre hémocytes circulant, d'importants composants cellulaires et les pathogènes qui encapsulent engloutir 5, 6. Les chercheurs n'ont pas trouvé de preuves pour les tissus hématopoïétiques chez les moustiques et les preuves actuelles suggèrent que le nombre d'hémocytes est fixé à l'émergence des adultes et des numéros peuvent en fait diminuer à mesure que l'âge des moustiques 7. La capacité à percevoir et identifier les hémocytes d'insectes d'importance médicale est une étape essentielle pour les études de l'immunité cellulaire. Cependant, la petite taille des moustiques et du volume limité d'hémolymphe posent un défi à la collecte de cellules immunitaires.

Deux méthodes établies pour la collecte des moustiques hémocytes notamment l'expulsion de l'hémolymphe d'une coupe proboscis 8, et le déplacement de volume (perfusion), dans lequel une solution saline est injectée dans la région membraneuse necklike entre la tête et du thorax (c'est à dire, du col utérin) et l'hémolymphe perfusés sont collectées d'une ouverture déchirée dans une région distale de l'abdomen 9, 10. Ces techniques sont cependant limitées par faible récupération des hémocytes et une possible contamination par des cellules de graisse du corps, respectivement 11. Plus récemment, une méthode appelée injection haute / Récupération améliorée d'immunocytes par l'utilisation de tampons anti-coagulant, tout en réduisant les niveaux d'échelles et de contaminer les tissus internes 11. Bien que cette méthode permet une meilleure méthode de collecte et de conservation hémocytes pour la culture primaire, il comporte un certain nombre d'injection et les étapes de collecte qui ne sont pas nécessaires si l'objectif est de recueillir l'aval, fixer et colorer hémocytes pour les diagnostics. Ici, nous démontrons notre méthode de collecte des moustiques hémolymphe qui allie la simplicité de la perfusion, l'aide de tampons anticoagulant en place d'une solution saline, avec la précision des techniques d'injection élevée pour isoler les préparatifs propre de hémocytes de moustiques du genre Aedes.

Protocol

1. Préparation à l'avance de la collecte hémocytes Préparer une solution de diluant hémolymphe qui se compose de moyennes de 60% de Schneider, 10% de sérum fœtal bovin (FBS), et un tampon de citrate 30% (anticoagulant, 98 mM de NaOH, 186 mM NaCl, 1,7 mM EDTA, 41 mM d'acide citrique, pH 4,5) 11. Faire aliquotes de 1,0 mL qui peut être stocké à -20 ° C. Utiliser chaque aliquote qu'une seule fois (voir matériaux). Préparer des lames de microscope en verre (75 x 25 x …

Discussion

La méthode de collecte hémocytes décrite ici est modifiée à partir des méthodes précédemment publiées et permet d'isoler les préparatifs propre de hémocytes de moustiques du genre Aedes avec moins d'étapes. Bien que notre intérêt particulier réside dans la caractérisation des populations hémocytaires moustiques du genre Aedes, nous pensons que cette technique peut être appliquée à des groupes de moustiques d'autres, après les premiers essais sont effectués pour déterm…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Auteurs tiens à remercier John Frey et Ben Peterson pour l'élevage de moustiques. Nous remercions également Christine Davis et Gary Radice de l'aide pour micrographies hémocytaires. Cette recherche a été financée par l'Université de Richmond Arts & Sciences bourse d'été aux AA et les professeurs Qayum accorder à A. Telang.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Schneider’s Medium Sigma-Aldrich S0146  
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F0643  
Hema3 stain kit Fisher 123-869  
Glass needles
(borosilicate with filament)
Sutter Instrument BF100-78-10 1.0mm O.D. and 0.78mm I.D.
Needle puller Sutter Instruments Model P-87  
MicroInjector Tritech Research MINJ-PD  
Needle holder Tritech Research MINJ-4  

References

  1. Enayati, A., Hemingway, J. Malaria management: past, present, and future. Annu. Rev. Entomol. 55, 569-569 (2010).
  2. Medlock, J., Luz, P. M., Struchiner, C. J., Galvani, A. P. The impact of transgenic mosquitoes on dengue virulence to humans and mosquitoes. The American Naturalist. 174, 565-565 (2009).
  3. Baton, L. A., Garver, L., Xi, Z., Dimopoulos, G. Functional genomics studies on the innate immunity of disease vectors. Insect Sci. 15, 15-15 (2008).
  4. Thomas, R. E., Wu, W. K., Verleye, D., Rai, K. S. Midgut basal lamina thickness and dengue-1 virus dissemination rates in laboratory strains of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J. Med. Entomol. 30, 326-326 (1993).
  5. Bartholomay, L. C. Profiling infection responses in the haemocytes of the mosquito, Aedes aegypti. Insect Mol. Biol. 16, 761-761 (2007).
  6. Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15, 1-1 (2008).
  7. Hillyer, J. F. Age-associated mortality in immune challenged mosquitoes (Aedes aegypti) correlates with a decrease in haemocyte numbers. Cell. Microbiol. 7, 39-39 (2005).
  8. Chen, C. C., Laurence, B. R. In vitro study on humoral encapsulation of microfilariae: establishment of technique and description of reaction. International Journal for Parasitology. 17, 781-781 (1987).
  9. Beerntsen, B. T., Christensen, B. M. Dirofilaria immitis: effects on hemolymph polypeptide synthesis in Aedes aegypti during melanotic encapsulation reactions against Microfilariae. Exp. Parasitol. 71, 406-406 (1990).
  10. Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. The antibacterial innate immune response by the mosquito Aedes aegypti is mediated by hemocytes and independent of Gram type and pathogenicity. Microb. Infect. 6, 448-448 (2004).
  11. Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36, 891-891 (2006).

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Cite This Article
Qayum, A. A., Telang, A. A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (51), e2772, doi:10.3791/2772 (2011).

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