Preimplantación de embriones criopreservados pueden ser después de la colocación en una solución hipertónica de crioprotectores a causa deshidratación celular. Después de equilibrio, la formación de cristales de hielo se induce en la solución que rodea al embrión. Una mayor deshidratación se produce cuando el embrión se enfría lentamente a temperaturas bajo cero antes de sumergirse en nitrógeno líquido para su almacenamiento.
Preimplantación de embriones de ganado vacuno, ovejas y cabras pueden ser criopreservados para su almacenamiento a corto o largo plazo. Preimplantación de embriones consisten principalmente en agua, y evitar la formación intracelular de cristales de hielo durante el proceso de criopreservación es de suma importancia para mantener la viabilidad del embrión. Los embriones son colocados en una solución hipertónica (1,4 a 1,5 M) de un agente crioprotector (CPA) como el etilenglicol (EG) o glicerol (GLI) para crear un gradiente osmótico que facilita la deshidratación celular. Después de embriones alcanzar el equilibrio osmótico en la solución de APC, son individualmente cargado en la solución hipertónica CPA en pajuelas de 0,25 ml de plástico para congelar. Los embriones son colocados en un congelador velocidad controlada a una temperatura de -6 ° C. La formación de cristales de hielo se induce en la solución de CPA que rodea el embrión, y la cristalización provoca un aumento en la concentración de la CPA fuera del embrión, provocando una mayor deshidratación celular. Los embriones se enfría a una velocidad de 0,5 ° C / min, lo que permite una mayor deshidratación, a una temperatura de -34 ° C antes de ser sumergido en nitrógeno líquido (-196 ° C). Embriones congelados deben descongelarse antes de la transferencia a un receptor (sustituto) mujeres. Pajillas que contienen los embriones se retiran de la termo de nitrógeno líquido, que se celebró en el aire a temperatura ambiente durante 3 a 5 segundos, y se coloca en un baño de agua 37 ° C durante 25 a 30 segundos. Embriones criopreservados en GLI se colocan en una solución 1 M de sacarosa durante 10 minutos para la eliminación de la CPA antes de la transferencia a un receptor (sustituto) mujeres. Embriones congelados en EG, sin embargo, pueden ser directamente transferidos al útero de un destinatario.
Porque los embriones son, sobre todo de agua, es fundamental que los embriones de preimplantación adecuadamente deshidratado y se enfrió lentamente, de acuerdo con el protocolo descrito en este documento para evitar la formación de cristales de hielo intracelular. Una vez que el proceso de enfriamiento ha comenzado, es importante para mantener los cambios de temperatura y unidireccional para evitar las fluctuaciones de temperatura. Inicio de la formación de cristales de hielo ("siembra") a una temperatura adecuada para la solución específica del CPA es fundamental.
Las modificaciones a este enfriamiento lento / método rápido deshielo de la criopreservación de embriones de preimplantación incluyen el método de un solo paso (en la última columna del medio de carga en la paja es la sacarosa en lugar de solución CPA) 19 y el método de transferencia directa (cuando los embriones congelados en etilenglicol se descongelan y se transfieren directamente al útero de una hembra receptora sin quitar primero el glicol de etileno a partir del embrión) 20. Para reducir el volumen de etilenglicol depositado en el útero de una transferencia directa (DT) mujeres destinatario, es recomendable llenar la paja de 0,25 ml con 6 cm de la celebración de medio antes de continuar como se describió anteriormente. Cabe señalar que existe una norma voluntaria dentro de la industria de transferencia de embriones comercial que preimplantación de embriones criopreservados para su DT deben ser congelados de color amarillo paja y se almacena en copas de color amarillo en el termo de nitrógeno líquido. El sector comercial también tiene requisitos específicos de etiquetado para todos los embriones congelados que se deben seguir.
Una alternativa a este método es la vitrificación de 21 años, el método de no equilibrio de criopreservación, donde se enfría una mayor concentración (6.8 M) CPA solución ultra-rápidamente causando la solución APC para cambiar de estado líquido a una "vidriosa" estado sin hielo la formación de cristales. La vitrificación es probablemente más adecuado para la crioconservación de embriones que son menos avanzados que el desarrollo de mórula compacta debido a su sensibilidad a la temperatura aumenta.
Esta técnica tiene una aplicación para la conservación de los recursos de germoplasma 22, así como a los internacionales de la industria comercial de la transferencia de embriones, donde más del 55% de los aproximadamente 500.000 preimplantación de embriones de bovino transferidos en el año calendario 2008 fueron criopreservados. 23
The authors have nothing to disclose.
Financiación parcial del proyecto de investigación del USDA en varios estados W-2171 "de células germinales y el desarrollo embrionario y la manipulación para la Mejora de la Ganadería" se agradece. El talento artístico de Ryan Callahan, quien preparó las ilustraciones técnicas para la parte de vídeo de este artículo, también se agradece.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
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BioLife freeze medium | Agtech, Inc. | C18, C18A | 1.5 M ethylene glycol |
Emcare ethylene glycol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC8, IC10 | 1.5 M ethylene glycol |
ViGro ethylene glycol freeze plus | Bioniche Animal Health | EVM835 | 1.5 M ethylene glycol |
Emcare 10% glycerol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC12 | 1.34 M glycerol |
Emcare 1 M sucrose thaw | ICPBio Reproduction | IC16 | 1.0 M sucrose |
ViGro one-step thaw | Bioniche Animal Health | EVM247, EVM847 | 1.0 M sucrose |
ViGro thaw 1-2-3 plus | Bioniche Animal Health | EVM248, EVM848 | 5%, 2.5%, 0% glycerol with 0.5, 0.5, 0.6% sucrose |
Emcare CSU thawing kit | ICPBio Reproduction | IC20 | 6%, 3%, 0% glycerol with 10.3% sucrose |
BioLife holding and transfer medium | Agtech, Inc. | C15, C15A | modified PBS with 0.4% BSA (bovine serum albumin) |
Emcare holding solution | ICPBio Reproduction | IC2, IC4, IC6 | 0.4% BSA (bovine serum albumin), MOPS buffer (inert zwitterions) |
ViGro holding plus | Bioniche Animal Health | EVM024, EVM824 | |
SYNGRO Holding medium | Bioniche Animal Health | ESM024, ESM224, ESM828 | contains hyaluronan; no products of animal origin |
BioLife modified D- PBS | Agtech, Inc. | C06 | modified Dulbecco’s phosphate buffered saline |
BioLife BSA Fraction V | Agtech, Inc. | B09 | lyophilized bovine serum albumin, fraction V |
BioLife antibiotic-antimycotic | Agtech, Inc. | B01 | amphotericin-B, penicillin G, streptomycin sulfate |
BioLife trypsin kit | Agtech, Inc. | C22A | 25 g lyophilized trypsin, sterile water, sterile D-PBS |
Name of the equipment | Company | Catalog number | Comments (optional) |
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Biol-Cool controlled rate freezer | FTS Systems | BC-IV -40 | Methanol bath freezer |
Freeze Control controlled rate freezer | Cryologic | CL2200 | Liquid nitrogen freezer |