قد يكون سابق للانغراس الأجنة cryopreserved بعد التنسيب إلى حل واق من البرد مفرط التوتر يسبب الجفاف الخلوية. بعد موازنة ، يتم بفعل الجليد تشكيل الكريستال في حل المحيطة الجنين. مزيد من الجفاف كما يحدث يبرد ببطء لدرجات حرارة تحت الصفر الجنين قبل سقوطها في النيتروجين السائل للتخزين.
قد يكون سابق للانغراس الأجنة cryopreserved من الأبقار والأغنام والماعز لتخزين قصيرة أو طويلة الأجل. سابق للانغراس الأجنة وتتكون أساسا من الماء ، وتجنب تشكيل الكريستال الجليد بين الخلايا أثناء عملية الحفظ بالتبريد هو من أهمية قصوى للحفاظ على سلامة الجنين. توضع الأجنة في حل مفرط التوتر (1،4-1،5 م) من عامل واق من البرد (CPA) مثل جلايكول الإيثيلين (EG) أو الجلسرين (GLYC) لإنشاء التدرج التناضحي التي تسهل الجفاف الخلوية. بعد الوصول إلى توازن التناضحي الأجنة في حل سلطة الائتلاف المؤقتة ، التي يتم تحميلها منفردة في حل سلطة الائتلاف المؤقتة مفرط التوتر في قش البلاستيك 0.25 مل التجميد. توضع الأجنة في الفريزر معدل تسيطر على درجة حرارة مئوية -6 وبفعل الجليد تشكيل الكريستال في حل سلطة الائتلاف المؤقتة التي تحيط بالجنين ، وتبلور يسبب زيادة في تركيز سلطة الائتلاف المؤقتة خارج الجنين ، مما تسبب في مزيد من الجفاف الخلوية. ويتم تبريد أجنة بمعدل 0.5 درجة دقيقة / C ، مما يتيح المزيد من الجفاف ، وإلى درجة حرارة -34 درجة مئوية قبل أن سقطت في النيتروجين السائل (-196 درجة مئوية). يجب إذابة Cryopreserved الأجنة قبل نقلها إلى المتلقي (مركب) من الإناث. تتم إزالة القش التي تحتوي على أجنة من ديوار النيتروجين السائل ، الذي عقد في الهواء درجة حرارة الغرفة لمدة 3 إلى 5 ثوان ، ووضع في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة 25 إلى 30 ثانية. cryopreserved الأجنة في GLYC توضع في حل M 1 من السكروز لمدة 10 دقيقة لإزالة اتفاق السلام الشامل قبل نقلها إلى المتلقي (مركب) من الإناث. الأجنة في cryopreserved المصري ، ومع ذلك ، يمكن أن تنتقل مباشرة إلى الرحم من المتلقي.
تتكون في الغالب لأن الأجنة من المياه ، فمن الأهمية بمكان أن تكون الأجنة سابق للانغراس المجففة والمبردة كاف ببطء وفقا لبروتوكول الموصوفة هنا لتجنب تشكيل الخلايا الكريستال الجليد. مرة واحدة في عملية التبريد قد بدأت ، من المهم للحفاظ على اتجاه وتغير درجات الحرارة وتجنب التقلبات في درجات الحرارة. الشروع في تكوين بلورات الثلج ("بذور") في درجة حرارة مناسبة لإيجاد حل سلطة الائتلاف المؤقتة محددة أمر بالغ الأهمية.
تعديلات على هذا التبريد البطيء / سريعة الذوبان لطريقة الحفظ بالتبريد سابق للانغراس الجنين وتشمل طريقة من خطوة واحدة (حيث العمود الأخير من المتوسط تحميلها في القش هو الحل بدلا من السكروز CPA) (19) وأسلوب النقل المباشر (حيث الأجنة المجمدة في غليكول الاثيلين وإذابة ونقل مباشرة إلى رحم الأنثى المتلقية دون إزالة أول جلايكول الإثيلين من الجنين) 20. لتقليل حجم غليكول الاثيلين أودع في رحم النقل المباشر (DT) الأنثى المتلقية ، فإنه من المستحسن لملء القش 0.25 مل 6 سم مع عقد المتوسطة قبل المتابعة كما هو موضح سابقا. وتجدر الإشارة إلى أن معيار طوعي موجود في صناعة نقل الجنين التجارية التي ينبغي تجميد الأجنة لDT cryopreserved سابق للانغراس في اللون الأصفر وتخزينها في قش أصفر اللون في كؤوس ديوار النيتروجين السائل. صناعة تجارية كما متطلبات وضع العلامات المحددة لجميع الأجنة cryopreserved التي ينبغي اتباعها.
بديل واحد إلى هذا الأسلوب هو التزجيج 21 ، وهي طريقة غير متوازنة من حيث الحفظ بالتبريد هو تبريد أكثر مركزة للغاية حل سلطة الائتلاف المؤقتة (6-8 M) بسرعة فائقة مما تسبب في حل سلطة الائتلاف المؤقتة إلى التغيير من السائل إلى حالة "زجاجي" دون الجليد تشكيل الكريستال. التزجيج هو المرجح أكثر ملاءمة لحفظ البرودة الأجنة التي هي أقل تقدما تنمويا من morula المضغوط بسبب حساسيتها لزيادة درجة الحرارة.
هذه التقنية قد طلب الحفاظ على الموارد الوراثية الفريدة 22 ، فضلا عن الدولية التجارية جنين حيث تم نقل صناعة cryopreserved أكثر من 55 ٪ من حوالي 500،000 سابق للانغراس الأجنة البقرية نقل في السنة التقويمية 2008 (23).
The authors have nothing to disclose.
بتمويل جزئي من وزارة الزراعة الأميركية للأبحاث مشروع متعدد الدولة W – 2171 "خلية جرثومة وتطور الجنين والتلاعب لتحسين الثروة الحيوانية" هي بالتقدير والعرفان. هي أيضا من المواهب الفنية رايان كالاهان ، الذي أعد الرسومات الفنية للجزء الفيديو من هذه المادة ، بالتقدير والعرفان.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
BioLife freeze medium | Agtech, Inc. | C18, C18A | 1.5 M ethylene glycol |
Emcare ethylene glycol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC8, IC10 | 1.5 M ethylene glycol |
ViGro ethylene glycol freeze plus | Bioniche Animal Health | EVM835 | 1.5 M ethylene glycol |
Emcare 10% glycerol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC12 | 1.34 M glycerol |
Emcare 1 M sucrose thaw | ICPBio Reproduction | IC16 | 1.0 M sucrose |
ViGro one-step thaw | Bioniche Animal Health | EVM247, EVM847 | 1.0 M sucrose |
ViGro thaw 1-2-3 plus | Bioniche Animal Health | EVM248, EVM848 | 5%, 2.5%, 0% glycerol with 0.5, 0.5, 0.6% sucrose |
Emcare CSU thawing kit | ICPBio Reproduction | IC20 | 6%, 3%, 0% glycerol with 10.3% sucrose |
BioLife holding and transfer medium | Agtech, Inc. | C15, C15A | modified PBS with 0.4% BSA (bovine serum albumin) |
Emcare holding solution | ICPBio Reproduction | IC2, IC4, IC6 | 0.4% BSA (bovine serum albumin), MOPS buffer (inert zwitterions) |
ViGro holding plus | Bioniche Animal Health | EVM024, EVM824 | |
SYNGRO Holding medium | Bioniche Animal Health | ESM024, ESM224, ESM828 | contains hyaluronan; no products of animal origin |
BioLife modified D- PBS | Agtech, Inc. | C06 | modified Dulbecco’s phosphate buffered saline |
BioLife BSA Fraction V | Agtech, Inc. | B09 | lyophilized bovine serum albumin, fraction V |
BioLife antibiotic-antimycotic | Agtech, Inc. | B01 | amphotericin-B, penicillin G, streptomycin sulfate |
BioLife trypsin kit | Agtech, Inc. | C22A | 25 g lyophilized trypsin, sterile water, sterile D-PBS |
Name of the equipment | Company | Catalog number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Biol-Cool controlled rate freezer | FTS Systems | BC-IV -40 | Methanol bath freezer |
Freeze Control controlled rate freezer | Cryologic | CL2200 | Liquid nitrogen freezer |