Summary

Sept étapes pour Stellate Cellules

Published: May 10, 2011
doi:

Summary

Nous décrivons ici une méthode pour l'isolement de cellules étoilées du foie à partir du foie de souris. Pour la purification de cellules étoilées, les foies de souris sont digérés<em> In situ</em> Et<em> In vitro</em> Par la pronase-collagénase traitement préalable à la centrifugation en gradient de densité. Cette technique rendements très pure cellules étoilées du foie.

Abstract

Cellules étoilées du foie sont le foie-résident des cellules de morphologie en forme d'étoile et sont situés dans l'espace de Disse entre les cellules endothéliales sinusoïdales du foie et de 1,2 hépatocytes. Cellules étoilées sont dérivées à partir de précurseurs de moelle osseuse et de stocker jusqu'à 80% de la vitamine A totale du corps 1, 2. Lors de l'activation des cellules étoilées se différencier en myofibroblastes pour produire la matrice extracellulaire, contribuant ainsi à 3 fibrose hépatique. Basé sur leur capacité à se contracter, les cellules étoilées myofibroblastique peut réguler le tonus vasculaire associée à l'hypertension portale 4. Récemment, nous avons démontré que les cellules étoilées du foie sont des cellules présentant l'antigène puissants et peuvent activer les cellules NKT ainsi que les lymphocytes T conventionnels 5.

Nous présentons ici une méthode pour la préparation efficace des cellules étoilées du foie à partir du foie de souris. En raison de leur localisation périsinusoïdales, l'isolement de cellules étoilées du foie est un processus multi-étapes. Afin de rendre accessibles les cellules étoilées à l'isolement de l'espace de Disse, foies de souris sont perfusées in situ avec le E enzymes digestives pronase et la collagénase P. perfusion Après, le tissu hépatique est soumis à un traitement enzymatique supplémentaire avec pronase E et P dans la collagénase vitro. Par la suite, la méthode tire parti de l'énorme quantité de gouttelettes lipidiques de vitamine A-stockage dans les cellules étoilées du foie. Cette fonctionnalité permet la séparation des cellules étoilées du foie d'autres types de cellules par centrifugation sur un gradient de 8% Nycodenz. Le protocole décrit ici donne une population très pure et homogène de cellules étoilées. Pureté de la préparation peut être évaluée par coloration de la molécule marqueur protéique fibrillaire gliale acide (GFAP), avant l'analyse par microscopie à fluorescence ou cytométrie en flux. En outre, la microscopie optique révèle l'aspect unique de la forme d'étoile cellules étoilées du foie qui abritent de grandes quantités de gouttelettes lipidiques.

Pris ensemble, nous présentons un protocole détaillé pour l'isolement efficace des cellules étoilées du foie, y compris des images représentatives de leur aspect morphologique et d'expression GFAP qui aident à définir l'entité de cellules étoilées.

Protocol

Souris C57BL / 6 doit être utilisé à ~ 20 semaines d'âge ou plus âgés. L'utilisation de souris mâles pesant 25-30g est recommandée. Le rendement des cellules étoilées peut être augmentée par l'alimentation des souris de la vitamine A régime enrichi pour 2 mois avant l'isolement de cellules étoilées. Environ 2×10 5 cellules étoilées du foie peut être purifié à partir du foie d'un C57BL / 6 de la souris, alors que le rendement des cellules étoilées du souris Balb / c es…

Discussion

Cellules étoilées du foie réguler essentielles des processus physiologiques et physiopathologiques dans le foie. Par ailleurs, les cellules étoilées possèdent des propriétés présentant un antigène, les rendant une composante importante de la réponse immunitaire hépatique. Bien que les cellules étoilées hépatiques comprennent 10-15% du nombre total de cellules dans le foie, l'isolement de ces cellules est difficile en raison de leur localisation dans l'espace de Disse périsinusoïdales.

<p cla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par le Prix de la famille Smith pour l'excellence en recherche biomédicale et les NIH RO1 AI083426-01 (FW). Patrick Maschmeyer et Melanie Flach sont soutenus par des bourses de doctorat de la Fondation de Boehringer Ingelheim.

Materials

Name Of Reagent Company Catalog No.
70μm Cell Strainer BD 352350
CaCL2 x 2H2O Sigma-Aldrich C3306
Collagenase P Roche 11249002001
DMEM Gibco 11960
DNase I Roche 10104159001
DPBS Cellgro 21-031-cv
EGTA Fluka 3777
Fetal Bovine Serum Gibco 16000
Glucose Sigma-Aldrich G7528
Gradient Centrifugation Tubes Greiner Bio-One 163160
HEPES Gibco 15630
KCL Sigma-Aldrich P9541
KH2PO4 Sigma-Aldrich P9791
L-Glutamine Gibco 25030
MgCl2 x 6H2O Fluka 63068
MgSO4 x 7H2O Sigma-Aldrich M2773
Na2HPO4 x 2H2O Fluka 71643
NaCl Sigma-Aldrich S3014
NaH2PO4 x H2O Fluka 71507
NaHCO3 Fluka 71628
Nycodenz Accudenz AG AN7050/BLK
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140
Peristaltic Pump Cole Parmer HV-7523-70
Phenol Red Sigma-Aldrich P4633
Pronase E Calbiochem 7433-2
Silicone Tube Masterflex HV-96440-14
Sodium Pyruvate Gibco 11360
Tissue culture flask (25cm2) BD 353108
Winged Infusion Set Terumo 1SV27EL

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Cite This Article
Maschmeyer, P., Flach, M., Winau, F. Seven Steps to Stellate Cells. J. Vis. Exp. (51), e2710, doi:10.3791/2710 (2011).

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