Não-cirúrgico instilação endotraqueal de camundongos com Análise de Pulmões e Drenagem Linfática Nodes Lung por citometria de fluxo
Summary
Nós ilustramos não-cirúrgico de entrega de materiais de teste para os pulmões de ratos anestesiados através da traquéia. Este método permite a exposição de pulmão a patógenos virais e bacterianas, citocinas, anticorpos, miçangas, químicos ou corantes. Iremos descrever colheita e processamento dos pulmões e dos gânglios linfáticos de drenagem de pulmão (LDLNs) para citometria de fluxo.
Abstract
Células fagocíticas, tais como macrófagos alveolares e células dendríticas pulmonares (PMD) continuamente amostra antígenos dos espaços alveolares nos pulmões. PMD, em particular, são conhecidos a migrar para o pulmão linfonodos de drenagem (LDLNs) onde apresentam antígenos inalados para células T iniciar uma resposta imune apropriada para uma variedade de imunógenos 1,2. Para modelar interações entre os pulmões e antígenos no ar em camundongos, os antígenos podem ser administradas por via intranasal 1,3,4, intratraqueal 5 ou 6 como aerossóis. Entrega por cada rota envolve distintas habilidades técnicas e limitações que precisam ser considerados antes de projetar um experimento. Por exemplo, a exposição intranasal e aerossol oferece antígenos para ambos os pulmões e do trato respiratório superior. Daí antígenos pode acessar o tecido linfóide associado nasal (NALT) 7, potencialmente complica a interpretação dos resultados. Além disso, engolir espirros, ea taxa de respiração do mouse também pode levar a inconsistências nas doses administradas. Embora o envolvimento do trato respiratório superior pode ser preferível para alguns estudos, pode complicar experimentos com foco em eventos especificamente iniciada nos pulmões. Neste cenário, a rota (it) intratraqueal é preferível, uma vez que fornece materiais de teste diretamente para os pulmões e ignora o NALT. Muitos protocolos que envolvem injeção de intubação ou cego da traquéia através da cavidade oral ou exposição cirúrgica da traquéia para acessar os pulmões. Relata-se um simples, consistente, o método não-cirúrgico para que a instilação. A abertura da traquéia é visualizado através de um laringoscópio e uma agulha torta sonda é inserido diretamente na traquéia para entregar o inóculo. Descrevemos também os procedimentos de colheita e processamento de LDLNs e pulmões para a análise do tráfico de antígeno por citometria de fluxo.
Protocol
Discussion
Nós utilizamos esse protocolo para estudo do tráfico de esporos de Bacillus anthracis dos pulmões para o LDLNs. Para aplicações semelhantes, o número de partículas entregues para os pulmões devem ser cuidadosamente escolhidos para que o material injetado pode ser detectado no LDLNs por citometria de fluxo. Temos também utilizado com sucesso este método para a transferência adotiva de células e rotulagem das populações específicas de células do pulmão através de anticorpos fluorescente etiqueta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 70μm Cell stariner | BD | ||
| Aniline Blue | Fisher | A967-25 | |
| Animal Feeding needle | Popper and Sons Inc | 7920 | |
| Collagenase | Sigma | C2139 | |
| Collagenase TypeIV | Worthington | ||
| Collagenase D | Roche | 11088974103 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm) | Polysciences, Inc | 17152 | |
| HBSS without Calcium chloride and magnesium chloride | Invitrogen | 14170 | |
| Ketamine HCl (100mg/ml) | Hospira Inc | ||
| Laryngoscope Blade | PennCentury, Inc | For Model LS-1 | Refer to www.penncentury.com |
| Lightweight Fiber Optic Laryngoscope | WelchAllyn | 80814 | |
| Red Fluorescent Beads (0.5μm) | Invitrogen | F8812 | For i.p injection |
| Xylazine (100mg/ml) | Lloyd Laboratories |
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