Summary

Nicht-chirurgische Intratrachealbiopersistenztest von Mäusen mit Analyse der Lungen-und Lungenforschung Lymphknoten mittels Durchflusszytometrie

Published: May 02, 2011
doi:

Summary

Wir illustrieren nicht-chirurgische Lieferung von Testmaterialien in den Lungen von narkotisierten Mäusen über die Luftröhre. Dieses Verfahren ermöglicht die Lunge Exposition gegenüber bakteriellen und viralen Erregern, Zytokine, Antikörper, Perlen, Chemikalien oder Farbstoffe. Wir beschreiben ferner die Ernte und Verarbeitung der Lunge und der Lunge Lymphknoten (LDLNs) für die Durchflusszytometrie.

Abstract

Phagozytierenden Zellen wie Alveolarmakrophagen und Lunge dendritischen Zellen (LDCs) kontinuierlich Probe Antigene aus dem Alveolarräumen in der Lunge. LDCs, insbesondere, sind dafür bekannt, in die Lunge Lymphknoten (LDLNs), wo sie vorhanden inhalative Antigene an T-Zellen zur Einleitung einer entsprechenden Immunantwort auf eine Vielzahl von Immunogenen 1,2. Migrieren Zur Modellierung Wechselwirkungen zwischen den Lungen und in der Luft-Antigene in Mäusen können Antigene intranasal 1,3,4 verabreicht werden, intratracheal 5 oder als Aerosole 6. Lieferung bis jede Route umfasst verschiedene technische Fähigkeiten und Einschränkungen, die vor der Gestaltung eines Experiments berücksichtigt werden müssen. Zum Beispiel liefert intranasale und Aerosol Exposition Antigene sowohl die Lungen und die oberen Atemwege. Daher Antigene können auf die Nase assoziierten lymphatischen Gewebe (NALT) 7, möglicherweise erschweren die Interpretation der Ergebnisse. Darüber hinaus können beim Schlucken, Niesen und die Atemfrequenz der Maus auch zu Inkonsistenzen in den Dosen geliefert führen. Obwohl die Beteiligung der oberen Atemwege bei einigen Studien bevorzugt werden, kann es die Experimente mit Schwerpunkt auf Veranstaltungen speziell in der Lunge ausgelöst. In dieser Einstellung wird die intratracheale (it) Route vorzuziehen, da sie Testmaterialien liefert direkt in die Lunge und umgeht die NALT. Viele es Injektion Protokolle beinhalten entweder blind Intubation der Luftröhre durch die Mundhöhle oder chirurgische Freilegung der Luftröhre in die Lunge zugreifen. Hier beschreiben wir eine einfache, konsistente, nicht-chirurgische Methode für die es Instillation. Die Öffnung der Luftröhre wird visualisiert mit einem Laryngoskop und eine gebogene Nadel Sonde wird dann direkt in die Luftröhre eingeführt, um die Inokulum zu liefern. Wir beschreiben auch Verfahren für die Ernte und Verarbeitung von LDLNs und Lunge für die Analyse von Antigen Handel mittels Durchflusszytometrie.

Protocol

1. Bevor der Prozess vorbereiten und sammeln Sie die folgenden Elemente Bitte beachten Sie das Bild in Abbildung 1a) und 1b) für den Bau einer hölzernen Plattform, um die Maus während des Verfahrens zu beschränken. Verdauung Mix für Lymphknoten – HBSS + 1.25mg/ml Collagenase TypIV oder 2,5 mg / ml Collagenase D Verdauung Mix für Lungen – HBSS + 1 mg / ml Collagenase Verdünnen Latexkügelchen (1:20) in PBS für intraperitoneale Injektion der LDLNs visualisieren <p…

Discussion

Wir haben dieses Protokoll genutzt werden, um den Handel mit Bacillus anthracis Sporen aus der Lunge zu den LDLNs studieren. Für ähnliche Anwendungen, sollte die Anzahl der Partikel, die die Lunge sorgfältig ausgewählt werden, so dass das eingespritzte Material in der LDLNs kann mittels Durchflusszytometrie detektiert werden. Wir haben auch erfolgreich diese Methode für adoptiven Transfer von Zellen und die Kennzeichnung von bestimmten Lungen-Zell-Populationen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern eingese…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
70μm Cell stariner BD    
Aniline Blue Fisher A967-25  
Animal Feeding needle Popper and Sons Inc 7920  
Collagenase Sigma C2139  
Collagenase TypeIV Worthington    
Collagenase D Roche 11088974103  
DPBS Invitrogen 14190  
Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm) Polysciences, Inc 17152  
HBSS without Calcium chloride and magnesium chloride Invitrogen 14170  
Ketamine HCl  (100mg/ml) Hospira Inc    
Laryngoscope Blade PennCentury, Inc For Model LS-1 Refer to www.penncentury.com
Lightweight Fiber Optic Laryngoscope WelchAllyn 80814  
Red Fluorescent Beads (0.5μm) Invitrogen F8812 For i.p injection
Xylazine (100mg/ml) Lloyd Laboratories    

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Cite This Article
Rayamajhi, M., Redente, E. F., Condon, T. V., Gonzalez-Juarrero, M., Riches, D. W., Lenz, L. L. Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (51), e2702, doi:10.3791/2702 (2011).

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