Умирающие клетки выдавливается из эпителиальной ткани согласованные сокращения соседние клетки, не нарушая барьерную функцию. Оптической прозрачности развития данио обеспечивает отличная система для визуализации экструзии в живых эпителия. Здесь мы опишем методы, чтобы вызвать и изображения экструзии в личиночной эпидермиса данио на клеточном разрешения.
Гомеостатические поддержания эпителиальных тканей требует постоянного удаления поврежденных клеток, не нарушая барьерную функцию. Наши исследования показали, что умирающие клетки посылают сигналы в их живых соседей, чтобы форма и контракт кольцо актина и миозина, что выбрасывает его из эпителиальных листа при закрытии каких-либо пробелов, которые могут быть результатом его выход, и этот процесс называется ячейка экструзии 1. Оптической прозрачности развития данио обеспечивает отличная система для визуализации экструзии в живых эпителия. Здесь мы опишем метод, чтобы побудить и изображения экструзии в личиночной эпидермиса рыбок данио. Для визуализации экструзии, мы вводим красный флуоресцентный белок меченного зонда для F-актина в одно-клеточной стадии трансгенных эмбрионов данио выражения зеленого флуоресцентного белка в эпидермис и вызывать апоптоз путем добавления G418 для личинок. Затем с помощью покадровой изображения на вращающийся диск конфокальной микроскопии для наблюдения динамики актина и эпителиальных поведения клетка в процессе апоптоза клетка экструзии. Такой подход позволяет исследовать процесс экструзии в живых эпителия и будет предоставлять проспект изучать болезненных состояний, вызванных неустранения апоптоза клеток.
Протокол, описанный здесь, демонстрирует простой и прямой способ для визуализации процесса экструзии в живых эпителиальной ткани. Такого рода эксперимент позволяет нам изучить тонкости актина динамики не ранее оценил в основной анализ ткани, и, следовательно, дополняет общую иммуноф?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим членов лаборатории Розенблатт для научных дискуссий, предложения и замечания. Мы также хотели бы поблагодарить Марию Халлоран который любезно предоставил плазмиды, кодирующей RFP-UtrCH и Дэвид Грюнвальд, которые предоставили CK: GFP трансгенных данио. Спасибо также Гретхен Король и сотрудниками централизованных ресурсов данио рерио в Университете штата Юта, за отличное обслуживание и уход за рыбок данио. Работа выполнена при поддержке нью-Новатор NIH-NIGMS NIH директора премии 1 DP2 OD002056-01 для JR. ГТД была поддержана NIH многопрофильная рака Программа обучения Грант 5T32 CA03247-8.
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
---|---|---|---|---|
RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR | 14672-608 | |
Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher | 08-757-12 | |
Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Company | Model P97 | |
Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Company | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments | E210 | |
Phenol Red | Reagent | Sigma | P0290 | 0.5% in DPBS |
Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
Low Melt Agarose | Reagent | Fisher | BP1360-100 | |
Tricaine | Reagent | Sigma | A-5040 | |
Dissecting Microscope | Microscope | Leica | MZ6 | |
Dissecting Microscope | Microscope | Nikon | SMZ645 | |
Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus | S2X12 | |
Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |