Imagens ao vivo de extrusão celular da epiderme de Zebrafish desenvolvimento
Summary
Células que morrem são extrudados a partir de tecidos epiteliais pela contração concertada de células vizinhas, sem interromper a função de barreira. A clareza óptica de zebrafish desenvolvimento fornece um excelente sistema de visualização de extrusão na vida epitélios. Aqui nós descrevemos métodos para induzir e extrusão imagem na epiderme zebrafish larval em resolução celular.
Abstract
Manutenção da homeostase dos tecidos epiteliais requer a remoção contínua de células danificadas, sem interromper a função de barreira. Nossos estudos descobriram que as células morrem enviar sinais para seus vizinhos ao vivo para formar e contratar um anel de actina e miosina que ejeta-lo para fora da folha epiteliais ao fechar eventuais lacunas que possam ter resultado de sua saída, um processo chamado de extrusão de células 1. A clareza óptica de zebrafish desenvolvimento fornece um excelente sistema de visualização de extrusão na vida epitélios. Aqui nós descrevemos um método para induzir e extrusão imagem na epiderme zebrafish larval. Para visualizar extrusão, injetamos uma sonda de proteína vermelha fluorescente etiquetados para F-actina em uma única célula de embriões em estágio zebrafish transgênicos expressando a proteína verde fluorescente na epiderme e induzir a apoptose através da adição de G418 para as larvas. Em seguida, usamos lapso de tempo imagem em um microscópio confocal disco giratório de observar a dinâmica de actina e comportamentos de células epiteliais durante o processo de extrusão celular por apoptose. Essa abordagem nos permite investigar o processo de extrusão em viver epitélios e irá fornecer uma avenida para estudar estados de doença causada pela incapacidade de eliminar as células apoptóticas.
Protocol
Discussion
O protocolo aqui descrito demonstra um método simples e direta para visualizar o processo de extrusão em um tecido vivo epiteliais. Este tipo de experimento nos permite examinar sutilezas de actina dinâmica antes não apreciada em análises de tecido fixado, e, portanto, complementa métodos comuns de imunofluorescência. Podemos usar este protocolo, em combinação com inibidores químicos ou mutantes genéticos para analisar melhor o processo de extrusão e estados de doença estudo associado à falha de remover e …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a membros do laboratório Rosenblatt para discussões científicas, sugestões e comentários. Gostaríamos também de agradecer a Mary Halloran, que gentilmente nos cedeu o plasmídeo RFP-UtrCH e David Grunwald que forneceu o CK: GFP transgênicos zebrafish. Obrigado também a Gretchen Rei e do pessoal da Resource Zebrafish centralizado na Universidade de Utah para excelente manutenção e cuidados com o peixe-zebra. Este trabalho foi financiado pelo NIH-Award NIGMS NIH Director do New Innovator uma DP2 OD002056-01 a JR. GTE foi apoiado pelo NIH Multidisciplinar de Câncer Programa de Treinamento Grant 5T32 CA03247-8.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|---|
| RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
| Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
| The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
| 5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR | 14672-608 | |
| Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| 100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher | 08-757-12 | |
| Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Company | Model P97 | |
| Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Company | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
| Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments | E210 | |
| Phenol Red | Reagent | Sigma | P0290 | 0.5% in DPBS |
| Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
| G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
| Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
| Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Low Melt Agarose | Reagent | Fisher | BP1360-100 | |
| Tricaine | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Leica | MZ6 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus | S2X12 | |
| Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
| CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |
References
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