Summary

Floresan immuno-Kimya tespiti için kullanılması Edwardsiella ictaluri Kanal kedibalığı ( I. punctatus) Örnekleri

Published: May 10, 2011
doi:

Summary

Burada etiketleme olanak sağlayan bir prosedür<em> In situ Edwardsiella ictaluri</em> Kanal kedibalığı histolojik kesitlerde<em> Ictalurus punctatus</em> Birincil ve ikincil olarak floresan FITC etiketli antikorlar monoklonal antikorlar ile dolaylı immünohistokimya Ed9. Bu tespiti için floresan mikroskopi kullanılarak bakterinin izin verdi.

Abstract

Kanal kedibalığı Ictalurus punctatus önemli bir patojen Edwardsiella ictaluri ve yaklaşık üç yıl 1,2 önce keşfetmiş oldu ederken, şimdiye kadar, bu yazarların bilgi en iyi, hiçbir yöntem in situ görselleştirme izin vermek için geliştirilmiş oldu histolojik kesitlerde bakteri.

Plaka sayıları 3, radyometrik etiketli 4, ya da bioluminescent bakteri 5 kullanarak önceki çalışmalar in vivo bakteriyel yerelleştirme belirlenecek olsa da, bu çalışmaların çoğu sadece bir istisna dışında 6 ile brüt organ seviyesinde olmuştur . Bu sınırlama özellikle endişe vericidir, çünkü E. ictaluri karmaşık bir enfeksiyon döngüsü 1,7 ve 8,9 virülans faktörleri bir çeşitlilik vardır. E. karmaşık bir etkileşim ictaluri, ev sahibi ile, aynı taksonomik aile içinde Salmonella typhi 10, birçok bakımdan benzer .

Burada Ainsworth ve ark tarafından tanımlanan monoklonal antikor Ed9 kullanarak dolaylı immün histokimya 11 kullanılarak bakterilerin tespiti için izin veren bir tekniktir .

Kısaca, engelleyici bir serum non-spesifik biding önlemek için parafin histolojik kesitlerde uygulanır. E.: Daha sonra, bölümleri birincil antikor ile inkübe edilir ictaluri spesifik monoklonal antikor Ed9. Aşırı antikorlar durulanır ve FITC etiketli sekonder antikor eklenir. Durulandıktan sonra, bir floresan özel montaj orta bölümleri ile monte edilir.

Bu tespiti E. için izin kanal kedibalığı dokuların histolojik kesitlerde in situ ictaluri.

Protocol

1. Bakteriyel meydan okuma 30 bakteri gecede büyütün ° C Beyin Kalp İnfüzyon suyu sallayarak. Balık tanklarında su sirkülasyonu durdurun ve 100 1 konsantrasyonu (Örneğin, litre başına 10 ml) suyu ekleyin. Bir saat inkübasyondan sonra, tanklarda kalan bakterilerin dışarı atılması için su sirkülasyonu yeniden başlatın. 2. Örnekleme Örnekleme zamanları ve organları çalışmanın amacı bağlıdır ama bizim çalı…

Discussion

Bu protokol, histolojik kesitlerde kedibalığı patojen Edwardsiella ictaluri yerinde görselleştirme için kullanılan bir tekniktir. Bizim bilgilerimize göre en iyi şekilde, bu açıklanan ilk böyle bir protokol.

En kritik adım, deneyimlerimiz, yanlış pozitif yol açabilir yetersiz yıkama gibi mevcut protokol adım 4.4 'de anlatıldığı gibi antikorların durulama.

, Bu tekniğin sonuçları yorumlama temel sorun doku otomatik floresan. …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Michelle Banes teknik yardımın yanı sıra Dr. Petrie-Hanson, Dr. Eels ve Timothy Brown, onların yardım ve immünohistokimya performans tanımak istiyoruz. Bu proje, ABD Tarım Bakanlığı CRIS proje # MISV-0801310 ve Veteriner Mississippi State University College tarafından finanse edildi.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Brain Infusion broth Becton Dickinson 237200
MS222 Argent Labs  
Whole mouse Serum Cappel 55989
Goat anti-mouse FitC Southern Biotech 1010-04
Permafluor Lab Vision Ta-030-FM
Potassium chloride (KCl) Sigma P-4504
Triton-X Sigma-Aldrich X100-6X500ML
Bovine Serum Albumin Sigma 85040C
Potassium phosphate (KH2PO4) Sigma P-5379
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma S-5761
Sodium chloride (NaCal) Sigma S-9625
Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) Sigma S-9390

References

  1. Plumb, J. A., Woo, P. T. K., Bruno, D. W. . Fish Diseases and Disorders. , 479-479 (1998).
  2. Roberts, R. J. . Fish Pathology. , (2001).
  3. Lawrence, M. L. . Louisiana State University. , (1997).
  4. Nusbaum, K. E., Morrisson, E. E. Entry of 35S-Labeled Edwardsiella ictaluri into Channel Catfish. Journal of Aquatic Animal Health. 8, 146-146 (1996).
  5. Karsi, A., Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. L. Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring. FEMS Microbiology Letters. 260, 286-286 (2006).
  6. Miyazaki, T., Plumb, J. A. Histopathology of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque). Journal of Fish Diseases. 8, 839-839 (1985).
  7. Areechon, N., Plumb, J. A. Pathogenesis of Edwardsiella ictaluri in Channel Catfish, Ictalurus punctatus. Journal of the World Mariculture Society. 14, 249-249 (1983).
  8. Dumpala, P. R., Lawrence, M. L., Karsi, A. Proteome analysis of Edwardsiella ictaluri. Proteomics. 9, 1353-1353 (2009).
  9. Thune, R. L. Signature-Tagged Mutagenesis of Edwardsiella ictaluri Identifies Virulence-Related Genes, Including a Salmonella Pathogenicity Island 2 Class of Type III Secretion Systems. Applied and Environmental Microbiology. 73, 7934-7934 (2007).
  10. Karsi, A. High-throughput bioluminescence mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2166-2166 (2009).
  11. Hook, E. W., Mandell, G. L., Douglas, G., Bennett, J. E. . Principles and Practices of Infectious Diseases. , 1700-1700 (1990).
  12. Ainsworth, J., Capley, G., Waterstreet, P., Munson, D. Use of monoclonal antibodies in the indirect fluorescent antibody technique (IFA) for the diagnosis of Edwardsiella ictaluri. Journal of Fish Diseases. 9, 439-439 (1986).

Play Video

Cite This Article
Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples. J. Vis. Exp. (51), e2687, doi:10.3791/2687 (2011).

View Video