Summary

L'uso di Immuno-fluorescenza Chimica per il rilevamento di Edwardsiella ictaluri In pesce gatto di canale ( I. punctatus) I campioni

Published: May 10, 2011
doi:

Summary

Qui si descrive una procedura che consenta l'etichettatura dei<em> Edwardsiella ictaluri in situ</em> In sezioni istologiche di pesce gatto di canale<em> Ictalurus punctatus</em> Utilizzando l'immunoistochimica indiretta con anticorpi monoclonali Ed9 come anticorpi FITC primario, e fluorescenti etichettato come secondario. Questo ha permesso per la rilevazione del batterio usando la microscopia a fluorescenza.

Abstract

Mentre Edwardsiella ictaluri è un patogeno importante canale di pesce gatto Ictalurus punctatus ed è stato scoperto quasi tre decenni fa 1,2, finora, per quanto a conoscenza di questi autori ', nessun metodo è stato sviluppato per consentire la visualizzazione in situ della batteri in sezioni istologiche.

Mentre la localizzazione batterica è stata determinata in vivo negli studi precedenti con conta piastra 3, radiometriche etichettati 4 o batteri bioluminescenti 5, la maggior parte di questi studi sono stati condotti solo a livello di organo lordo, con una sola eccezione 6. Questa limitazione è particolarmente preoccupante perché E. ictaluri ha un ciclo complesso infezione 1,7, ed ha una varietà di fattori di virulenza 8,9. La complessa interazione di E. ictaluri con il suo ospite è simile per molti aspetti a Salmonella typhi 10, che si trova nella stessa famiglia tassonomica.

Qui si descrive una tecnica che permette per la rilevazione di batteri utilizzando indiretto immunoistochimico utilizzando l'anticorpo monoclonale Ed9 descritto da Ainsworth et al. 11.

In breve, un siero blocco viene applicato paraffina sezioni istologiche incorporato per prevenire non specifici aspettando. Poi, le sezioni vengono incubate con l'anticorpo primario: E. ictaluri anticorpo monoclonale specifico Ed9. Anticorpi in eccesso vengono risciacquati via e la FITC anticorpi marcati secondari vengono aggiunti. Dopo il risciacquo, le sezioni sono montate con una fluorescente medio di montaggio specifiche.

Questo ha permesso per la rilevazione di E. ictaluri in situ in sezioni istologiche di tessuti pesce gatto di canale.

Protocol

1. Sfida batterica Crescere i batteri notte a 30 ° C in agitazione Cuore brodo cervello Infusion. Interrompere la circolazione dell'acqua nelle vasche di pesce e aggiungere il brodo nella concentrazione di 1 a 100 (10 ml per litro, per esempio). Dopo un ore di incubazione, riavviare la circolazione dell'acqua nelle vasche per scovare i batteri rimasti. 2. Campionatura Tempi di campionamento e gli organi dipende l'obiettivo de…

Discussion

Questo protocollo dettagli di una tecnica per la visualizzazione in situ del patogeno pesce gatto Edwardsiella ictaluri in sezioni istologiche. Per quanto a nostra conoscenza, questo è il primo protocollo come descritto.

La fase più critica, nella nostra esperienza, è il risciacquo degli anticorpi, come descritto nel passaggio 4.4 del presente protocollo come il lavaggio insufficiente può portare a falsi positivi.

Il problema principale con …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano riconoscere l'assistenza tecnica di Banes Michelle e Petrie-Hanson, Eels e il Dott. Timothy Brown, per la loro assistenza sviluppare ed eseguire il immunoistochimica. Questo progetto è stato finanziato dalla USDA CRIS progetto # MISV-0801310 e dal Mississippi State University College di Medicina Veterinaria.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Brain Infusion broth Becton Dickinson 237200
MS222 Argent Labs  
Whole mouse Serum Cappel 55989
Goat anti-mouse FitC Southern Biotech 1010-04
Permafluor Lab Vision Ta-030-FM
Potassium chloride (KCl) Sigma P-4504
Triton-X Sigma-Aldrich X100-6X500ML
Bovine Serum Albumin Sigma 85040C
Potassium phosphate (KH2PO4) Sigma P-5379
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma S-5761
Sodium chloride (NaCal) Sigma S-9625
Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) Sigma S-9390

References

  1. Plumb, J. A., Woo, P. T. K., Bruno, D. W. . Fish Diseases and Disorders. , 479-479 (1998).
  2. Roberts, R. J. . Fish Pathology. , (2001).
  3. Lawrence, M. L. . Louisiana State University. , (1997).
  4. Nusbaum, K. E., Morrisson, E. E. Entry of 35S-Labeled Edwardsiella ictaluri into Channel Catfish. Journal of Aquatic Animal Health. 8, 146-146 (1996).
  5. Karsi, A., Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. L. Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring. FEMS Microbiology Letters. 260, 286-286 (2006).
  6. Miyazaki, T., Plumb, J. A. Histopathology of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque). Journal of Fish Diseases. 8, 839-839 (1985).
  7. Areechon, N., Plumb, J. A. Pathogenesis of Edwardsiella ictaluri in Channel Catfish, Ictalurus punctatus. Journal of the World Mariculture Society. 14, 249-249 (1983).
  8. Dumpala, P. R., Lawrence, M. L., Karsi, A. Proteome analysis of Edwardsiella ictaluri. Proteomics. 9, 1353-1353 (2009).
  9. Thune, R. L. Signature-Tagged Mutagenesis of Edwardsiella ictaluri Identifies Virulence-Related Genes, Including a Salmonella Pathogenicity Island 2 Class of Type III Secretion Systems. Applied and Environmental Microbiology. 73, 7934-7934 (2007).
  10. Karsi, A. High-throughput bioluminescence mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2166-2166 (2009).
  11. Hook, E. W., Mandell, G. L., Douglas, G., Bennett, J. E. . Principles and Practices of Infectious Diseases. , 1700-1700 (1990).
  12. Ainsworth, J., Capley, G., Waterstreet, P., Munson, D. Use of monoclonal antibodies in the indirect fluorescent antibody technique (IFA) for the diagnosis of Edwardsiella ictaluri. Journal of Fish Diseases. 9, 439-439 (1986).

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Cite This Article
Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples. J. Vis. Exp. (51), e2687, doi:10.3791/2687 (2011).

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