מוות של תאים מתוכנת מבחני נפוץ במערכות יונקים כגון laddering דנ"א או מבחני TUNEL, לעיתים קרובות קשה לשחזר בצמחים. בשילוב עם מערכת הכתב גאס, אנו מציעים מהיר, assay המבוסס צמח חולף לנתח את המאפיינים מוות הפוטנציאל של גנים ספציפיים.
פיתחנו ביטוי רומן חולף צמח המערכת בו זמנית מבטא את הגן הכתב, β-glucuronidase (גאס), עם הרגולטורים חיובי או שלילי המשוערת של מוות של תאים. במערכת זו, נ עלים benthamiana הם שיתוף הסתננו עם קלטת ביטוי 35S מונע המכיל את הגן כדי להיות מנותח, ואת וקטור גאס pCAMBIA 2301 באמצעות LBA4404 Agrobacterium זן ככלי. מכיוון תאים חיים נדרשים עבור הביטוי גאס להתרחש, אובדן פעילות גאס צפוי כאשר הגן הזה הוא סמן שיתוף הביע עם הרגולטורים חיובי של מוות של תאים. באותה מידה, פעילות מוגברת גאס הוא ציין מתי אנטי אפופטוטיים גנים המשמשים לעומת שליטה וקטור. כפי שנראה להלן, השתמשנו בהצלחה את המערכת במעבדה שלנו לנתח את שניהם שחקנים בעד ונגד המוות. אלה כוללים את צמח אנטי אפופטוטיים Bcl-2 Associated athanoGene (שקית) משפחה, וכן, ידוע מעוררים יונקים של מוות של תאים, כגון BAX. בנוסף, יש לנו בשימוש במערכת זו כדי לנתח את הפונקציה מותו של truncations ספציפיים בתוך חלבונים, אשר יכול לספק רמזים על שינוי שלאחר translational ההפעלה אפשרי / של החלבונים האלה. כאן, אנו מציגים שיטה צמח מהיר ורגיש מבוסס, כצעד ראשוני בחקירת פונקציה מותו של גנים ספציפיים.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Rifampicin | VWR | IC19549001 | 25mg/mL stock in DMSO |
4′-hydroxy-3′,5′-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) | VWR | TCD2666 | 0.981 g/mL in DMSO (1M stock) |
2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate (MES) | VWR | EM-6110 | 1.92 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
Bacto-tryptone | Fisher | BP1421-2 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
Bacto-yeast extract | VWR | EM1.03753.0500 | 5g/L in water for making 1 L of LB medium |
Sodium chloride | VWR | EM-7710 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | VWR | MK-7868-12 | 2.5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate | VWR | EMD-SX0715-1 | 5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | EM-MX0070-1 | 2.5 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
N-Lauroylsarcosine | VWR | TCL0151-500G | 0.1% v/v in GUS buffer |
5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc) | Gold Biotechnology | G1281C | 1mg/100uL in methanol 100% |
4-Methylumbelliferyl-μ-D-glucuronide hydrate (MUG) | Sigma | M5664 | 2 mM in 100 uL of GUS extraction buffer |
Potassium ferrocyanide trihydrate | VWR | EM-PX1460-1 | 100mM stock for X-gluc substrate solution |
β-Methylumbelliferone (MU) | Sigma-Aldrich | M1381 | For MU standard curve use GUS extraction buffer |
Sodium carbonate | VWR | EM-SX0395-11 | 0.2 M in water for making GUS stop buffer |