Una pantalla de alto rendimiento para Biominería actividad de celulasa de bibliotecas metagenómicas
Summary
Este protocolo describe una pantalla de alto rendimiento para la actividad celulolítica de una biblioteca metagenómica expresado en Escherichia coli. La pantalla es la solución de base y altamente automatizado, y utiliza una olla de la química en microplacas de 384 y con la lectura final como una medida de la absorbancia.
Abstract
Celulosa, la fuente más abundante de carbono orgánico en el planeta, tiene una amplia gama de aplicaciones industriales con creciente énfasis en la producción de biocombustibles 1. Métodos químicos para modificar o degradar la celulosa por lo general requieren ácidos fuertes y altas temperaturas. Por lo tanto, los métodos enzimáticos se han convertido en prominente en el proceso de bioconversión. Mientras que la identificación de las celulasas activa de los aislamientos de bacterias y hongos ha sido algo eficaz, la gran mayoría de los microbios en la naturaleza resistir el cultivo de laboratorio. Genómica medioambiental, también conocido como enfoques metagenómica, la selección tiene una gran promesa en la reducción de la brecha de cultivo en la búsqueda de enzimas bioconversión novela. Métodos de detección metagenómica ha recuperado celulasas novela de entornos tan variados como los suelos 2, 3 y búfalos rumen de las termitas traseras-gut 4 utilizando carboximetilcelulosa (CMC) placas de agar se tiñeron con colorante rojo Congo (basado en el método de Teatro y Madera 5). Sin embargo, el método CMC está limitado en el rendimiento, no es cuantitativo y se manifiesta una señal de baja a ruido 6. Otros métodos se han reportado 7,8, pero cada uno utiliza una placa de agar-ensayo basado, que es indeseable para la selección de alto rendimiento de las grandes bibliotecas de insertar genómica. Aquí les presentamos una solución basada en la pantalla de actividad de celulasa usando un dinitrofenol cromogénico (DNP)-cellobioside sustrato 9. Nuestra biblioteca fue clonado en el control de copia PCC1 fosmid para aumentar la sensibilidad del ensayo a través de la inducción de copiar el número 10. El método utiliza una olla de la química en 384 pocillos con la lectura final, siempre como una medida de la absorbancia. Esta lectura es cuantitativo, sensible y automatizada con un rendimiento de hasta 100 veces las placas de 384 pocillos al día usando un manejador de líquidos y lector de placas con sistema conectado de apilamiento.
Protocol
Discussion
Una pantalla de alto rendimiento para la detección rápida de la actividad celulolítica de una biblioteca genómica de gran metagenómica insertar ADN expresado en E. coli se describe en este protocolo. Este método es una mejora con respecto a la prueba CMC / Rojo Congo de uso común en la literatura. Es una solución basada, y permite una olla de detección química en placas de 384 pocillos, con el resultado final de las lecturas de absorbancia de un lector de placas que permite el análisis cuantitativo. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Dr. Steve Withers y Chen Hong-Ming para proporcionar DNP-Cellobioside sustrato.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| qPix2 | Genetix | With 384-pin gridding head | ||
| qFill3 | Genetix | With 384-well manifold | ||
| Varioskan | Thermo-Fisher | |||
| RapidStak | Thermo-Fisher | Connected to Varioskan | ||
| Micro90 Detergent | Cole-Parmer | 18100-00 | Diluted to 2% in water | |
| Ethanol | Major Lab Supplier | Diluted to 80% in water | ||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | 12.5mg/mL in ethanol | |
| LB broth, Miller | Fisher | BP1426-2 | 25g/L, autoclaved | |
| 384-well flat bottom plates | Corning | 3680 | ||
| L-(+)-Arabinose | Sigma | A3256 | 100mg/mL in water | |
| Potassium Acetate | Fisher | P171 | 50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | ||
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | In TE buffer solution, 100mM | |
| EDTA disodium salt | Sigma | E5134 | In TE buffer solution, 10mM | |
| 2,4-dinitrophenyl cellobioside | Provided by Dr. Steve Withers, UBC | |||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 |
References
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