Экран с высоким Пропускная Biomining Целлюлаза активность метагеномных из библиотеки
Summary
Этот протокол описывает экран высокого пропускную способность для целлюлолитических деятельности от метагеномных библиотеки выражается в кишечной палочки. Экран урегулирования, основанного и высокой степенью автоматизации, и использует одну-пот в 384 химии и планшеты с окончательным считывания как измерения абсорбции.
Abstract
Целлюлоза, самый богатый источник органического углерода на планете, имеет широкий круг промышленных применений с увеличением акцента на производство биотоплива 1. Химические методы для изменения или деградации целлюлозы как правило, требуют сильных кислот и высоких температур. Таким образом, ферментативные методы стали видные в биоконверсии процесса. В то время как идентификация активных целлюлаз от бактериальных и грибковых изолятов был несколько эффективных, подавляющее большинство микробов в природе противостоять лаборатории культивирования. Экологические геномной, также известный как метагеномных, скрининг подходы большие надежды в преодолении разрыва в выращивание поиск новых ферментов биоконверсии. Метагеномных подходов скрининга успешно восстановлен роман целлюлозы из сред, столь же разнообразны, как почвы 2, буйволов рубца 3 и термитов задних кишки 4 с использованием карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) агаром окрашивают конго красного красителя (на основе метода Teather и деревообрабатывающей 5). Тем не менее, CMC метод ограничен по пропускной способности, не количественные и проявляется низким отношением сигнал-шум 6. Другие методы были зарегистрированы 7,8, но каждое использование агар пластины основе анализа, что является нежелательным для высокопроизводительного скрининга больших библиотек геномной вставки. Здесь мы представляем на базе решений экран для целлюлазы активности с использованием хромогенного динитрофенол (DNP)-cellobioside подложки 9. Наша библиотека была клонирована в pCC1 управления копированием fosmid увеличить чувствительность анализа по количеству копий индукции 10. Метод использует одно-пот химии в 384-луночных микропланшетов с окончательным считывания предоставляется в качестве измерения абсорбции. Данное показание является количественным, чувствительные и автоматизированные с пропускной способностью до 384-100X также пластин в день, используя жидкий проводник и ридер с прикрепленными укладки системы.
Protocol
Discussion
Высокая пропускная способность экрана для быстрого обнаружения целлюлолитических деятельности от большой библиотеки геномной ДНК вставки метагеномных выражается в Е. кишечной описано в данном протоколе. Этот метод является улучшением по сравнению с CMC / конго красный анализ шир…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить д-р Стив Холка и Гонг-Ming Chen за предоставление DNP-Cellobioside подложки.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| qPix2 | Genetix | With 384-pin gridding head | ||
| qFill3 | Genetix | With 384-well manifold | ||
| Varioskan | Thermo-Fisher | |||
| RapidStak | Thermo-Fisher | Connected to Varioskan | ||
| Micro90 Detergent | Cole-Parmer | 18100-00 | Diluted to 2% in water | |
| Ethanol | Major Lab Supplier | Diluted to 80% in water | ||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | 12.5mg/mL in ethanol | |
| LB broth, Miller | Fisher | BP1426-2 | 25g/L, autoclaved | |
| 384-well flat bottom plates | Corning | 3680 | ||
| L-(+)-Arabinose | Sigma | A3256 | 100mg/mL in water | |
| Potassium Acetate | Fisher | P171 | 50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151 | ||
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | In TE buffer solution, 100mM | |
| EDTA disodium salt | Sigma | E5134 | In TE buffer solution, 10mM | |
| 2,4-dinitrophenyl cellobioside | Provided by Dr. Steve Withers, UBC | |||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 |
References
- Rubin, E. M. Genomics of cellulosic biofuels. Nature. 454, 841-845 (2008).
- Voget, S., Steele, H. L., Streit, W. R. Characterization of a metagenome derived halotolerant cellulase. J. Biotechnol. 126, 26-36 (2006).
- Duan, C. J. Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens. J. Appl. Microbiol. 107, 245-256 (2009).
- Zhang, Y. H. P. Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies. Biotech. Advances. 24, 452-481 (2006).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl. And Environ. Microbiol. 43, 777-780 (1982).
- Sharrock, K. R. Cellulase assay methods: a review. J. Biochem and Biophys Methods. 17, 81-106 (1988).
- Kasana, R. C., Salwan, R., Dhar, H., Dutt, S., Gulati, A. A rapid and easy method for detection of microbial cellulases on agar plates using Gram’s Iodine. Curr. Microbiology. 57, 503-507 (2008).
- Huang, J. S., Tang, J. Sensitive assay for cellulase and dextranase. Anal. Biochem. 73, 369-377 (1976).
- Tull, D., Withers, S. G. Mechanisms of cellulases and xylanases: A detailed kinetic study of the exo-beta-1,4-glycanase from Cellulomonas fimi. Biochemistry. 33, 6363-6370 (1994).
- Martinez, A., Bradley, A. S., Waldbauer, J. R., Summons, R. E., DeLong, E. F. Proteorhodopsin photosystem gene expression enables photophosphorylation in a heterologous host. PNAS. 104, 5590-5595 (2007).
- Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large Insert Environmental Genomic Library Production. J Vis Exp. , (2009).
- Martinez, A., Tyson, G. W., DeLong, E. F. Widespread known and novel phosphonate utilization pathways in marine bacteria revealed by functional screening and metagenomic analyses. Environ Microbiol. 12, 222-238 (2010).
- Wild, J., Hradecna, Z., Szybalski, W. Conditionally amplifiable BACs: Switching from single-copy to high-copy vectors and genomic clones. Genome Research. 12, 1434-1444 (2002).
- Johnson, E. A. Sacchirification of complex cellulosic substrates by the cellulase system from Clostridium thermocellum. Appl Environ Microbiology. 43, 1125-1132 (1982).
- Stutzenberger, F. J. Cellulase Production by Thermomonospora curvata isolated from municipal solid waste compost. Appl Environ Microbiol. 22, 147-152 (1971).
