Un metodo per visualizzare e quantificare F-actina finisce spinato nei coni di crescita neuronale è descritto. Dopo i neuroni colture sulla coprioggetto di vetro, le cellule sono permeabilizzate con una soluzione contenente saponina. Poi, una breve incubazione con il buffer che contiene saponina rodamina-actina actina incorpora fluorescenti sul termina actina libera spinato.
Le punte mobili di assoni in crescita sono chiamati coni di crescita. Coni di crescita degli assoni conducono navigare attraverso i tessuti in via di sviluppo, interagendo con spunti a livello locale ha espresso la guida molecolare che si legano recettori cono di crescita e regolano le dinamiche e l'organizzazione del citoscheletro cono di crescita del 3-6. L'obiettivo principale di questi segnali di navigazione è il reticolo di filamenti di actina che riempie la periferia cono di crescita e che la crescita unità motilità del cono attraverso la polimerizzazione di actina e continuo rimodellamento dinamico 7. Spunti interessanti indicazioni positive o indurre il cono di crescita di svolta stimolando filamenti di actina (F-actina) polimerizzazione nella regione della periferia cono di crescita che è più vicino alla fonte della stecca attrattiva. Questa la polimerizzazione di actina unità locali cono di crescita sporgenza, l'adesione del margine di leader e di allungamento assonale verso l'attrattore.
Polimerizzazione filamento dipende dalla disponibilità di monomero di actina sufficiente e su nuclei di polimerizzazione o termina filamenti di actina spinato per l'aggiunta di monomero. Actina monomero è abbondantemente disponibile nel ganglio della radice pulcino della retina e dorsale (DRG) coni di crescita. Di conseguenza, polimerizzazione aumenta rapidamente quando libero F-actina finisce spinato diventano disponibili per oltre monomero. Ciò si verifica in pulcino DRG e coni di crescita della retina mediante l'attivazione locale della F-actina actina rottura delle proteine depolimerizzazione fattore (ADF / cofilina) nella regione del cono di crescita più vicini ad un 80-10 attrattivo. Questa accresciuta ADF / cofilina attività separa i filamenti di actina per creare nuovi F-actina finisce spinato per la polimerizzazione. Il metodo seguito viene illustrato questo meccanismo. Contenuto totale di F-actina sono visibili con la colorazione falloidina fluorescenti. F-actina finisce spinato sono visualizzati con l'incorporamento di rodamina-actina all'interno di coni di crescita che sono permeabilizzate con la procedura descritta nel seguente, che è tratto da studi precedenti di altre cellule mobili 11, 12. Quando rodamina-actina è aggiunto ad una concentrazione al di sopra della concentrazione critica per oltre monomero di actina a fini spinato, rodamina-actina assembla sulla libera finisce spinato. Se lo spunto interessante è presentato in un gradiente, come essere liberati da una micropipetta posizionata su un lato di un cono di crescita, l'incorporazione di rodamina-actina su F-actina finisce spinato sarà maggiore nella parte cono di crescita verso la micropipetta 10 .
Coni di crescita sono strutture a piccole cellule e delicato. Le procedure di permeabilizzazione, rodamina-actina incorporazione, la fissazione e la visualizzazione di fluorescenza sono tutte curate e possono essere effettuate sul palcoscenico di un microscopio invertito. Questi metodi possono essere applicati allo studio di polimerizzazione locali actina nei neuroni migrazione, altre cellule del tessuto primarie o linee cellulari.
I metodi qui presentati permettono risoluzione temporale e spaziale dei componenti cellulari che sono coinvolti nel rimodellamento dinamica del citoscheletro di actina al margine leader di migrazione coni di crescita. L'azione di molecole attrattivo, come NGF o netrina, per stimolare rapidamente polimerizzazione filamento si rivela come un aumento locale finisce actina spinato, creato da rottura di filamenti di actina attivato ADF / cofilina 10, come indicato nelle figure 1 e 2. Il metodo permette la loca…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano il Dr. James Bamberga ei membri del suo laboratorio per la collaborazione in questi studi. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni NIH HD19950, EY07133 e da finanziamenti della Minnesota Medical Foundation.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
18×18 mm coverslip | Gold Seal | 3305 | ||
35mm Petri dishes | Falcon | 351008 | ||
Aquarium cement | DAP 100% silicone aquarium sealant | Any hardware store | ||
Poly-D-lysine (mw > 300,000) | Sigma | P1024 | ||
Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | ||
L1 CAM | R & D systems | 777-NC | ||
Alexa-fluor 350 phalloidin | Invitrogen (Molecular Probes) | A22281 | ||
Rhodamine non-muscle actin | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | ||
F12 Culture medium | Invitrogen (Gibco) | 21700-075 | ||
B27 | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | ||
Slowfade | Invitrogen | 536937 |