Summary

שיטות מניפולציות ניסויית, לאחר חיתוך רוחב עצב הראייה של מערכת העצבים המרכזית היונקים

Published: May 12, 2011
doi:

Summary

חיתוך רוחב עצב הראייה הוא מודל בשימוש נרחב של פגיעה במערכת העצבים המרכזית מבוגר. מודל זה הוא אידיאלי עבור ביצוע מספר מניפולציות ניסיוני כי היעד של הרשתית גלובלי או ישירות ליעד אוכלוסייה של תאים עצביים נפצעו הגנגליון ברשתית.

Abstract

בתאי גנגליון רשתית (RGCs) הם נוירונים במערכת העצבים המרכזית, כי פלט מידע חזותי מהרשתית אל המוח, באמצעות עצב הראייה. העצב האופטי ניתן לגשת בתוך מסלולו של העין transected לחלוטין (axotomized), חיתוך האקסונים של האוכלוסייה RGC כולו. חיתוך רוחב עצב הראייה הוא מודל לשחזור של מוות תאים אפופטוטיים נוירונים ב CNS הבוגרת 1-4. מודל זה הינו אטרקטיבי במיוחד מאחר קאמרית הזגוגית של העין פועלת כמו כמוסה עבור משלוח הסמים אל הרשתית, המתיר מניפולציות ניסיוני באמצעות זריקות התוך עיני. דיפוזיה של חומרים דרך הנוזל הזגוגי מבטיחה כי הם פועלים על האוכלוסייה RGC כולו. וקטורים ויראליים, פלסמידים או RNAs התערבות קצר (siRNAs) יכול גם להיות מועברת לתא זגוגי על מנת להדביק תאים ברשתית או transfect 5-12. כמיהות גבוהה של Adeno-Associated Virus (AAV) וקטורים מועילה RGCs היעד, עם שיעור זיהום מתקרב 90% של תאים ליד הזריקה 6, 7, 13-15. יתר על כן, RGCs ניתן transfected סלקטיבי על ידי יישום siRNAs, פלסמידים, או וקטורים ויראליים לסוף חתך של עצב הראייה 16-19 או וקטורים הזרקה לתוך היעד שלהם colliculus מעולה 10. הדבר מאפשר לחוקרים לבחון מנגנונים אפופטוטיים באוכלוסייה העצבית נפגע ללא תופעות בלבול על נוירונים אחרים או עובר אורח גליה שמסביב. RGC אפופטוזיס יש מאפיין זמן כמובן לפיה מוות של תאים מתעכב postaxotomy 3-4 ימים, אחרי אשר התאים להידרדר במהירות. זה מספק חלון מניפולציות ניסיוני נגד מסלולים מעורב אפופטוזיס. מניפולציות ישירות היעד RGCs מן הגדם transected עצב הראייה מבוצעים בזמן axotomy, מיד לאחר חיתוך העצב. לעומת זאת, כאשר חומרים מועברים דרך המסלול התוך עיני, הם יכולים להיות מוזרק לפני הניתוח או בתוך 3 הימים הראשונים לאחר הניתוח, שלפני תחילת אפופטוזיס RGCs axotomized. במאמר הנוכחי, אנחנו מדגימים כמה שיטות ניסיוניות מניפולציות לאחר חיתוך רוחב עצב הראייה.

Protocol

1. טכניקה כירורגית ניסויים אמור להתבצע באמצעות הטכניקה aseptic ובעקבות השימוש בבעלי חיים פרוטוקולים של המוסד הספציפי שלך. כלים וחומרים (פתרונות, חומרים הבדיקה, קליעים נותבים, מחטים וכו '), לבוא במגע עם רקמה חיה חייב להיו?…

Discussion

חיתוך רוחב עצב הראייה הוא מודל לשחזור ביותר של אפופטוזיס CNS מבוגר נוירון. מניפולציות הניסוי הפגינו כתב היד הזה היתר חקר מנגנוני אפופטוזיס RGC לאחר פציעה.

זריקות תוך עיניות שימושיים המיקוד העולמי של הרשתית. הליך זה דורש קצת תרגול, כ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

PDK נתמך על ידי מענק ההפעלה CIHR (MOP 86523)

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Stereotaxic Frame   Stoelting, Kopf, WPI    
Rat Gas Mask   Stoelting, Kopf, WPI    
Anesthesia System   VetEquip 901806  
Isoflurane (PrAErrane)   Baxter Corp DIN 02225875  
Surgical Microscope   WPI, Zeiss, Leica    
Alcaine Eye Drops   Alcon    
Tears Naturale P.M.   Alcon    
Fine tip Dumont forceps   Fine Science Tools 11252-00  
10 μl Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2”/2)   Hamilton Syringe Co. 80030  
1/16 inch Compression Fittings   Hamilton Syringe Co. 55751-01  
1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing   Supelco, Bellefonte, PA Z226661  
Dual RN Glass Coupler   Hamilton Syringe Co. 55752-01  
Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa   Hamilton Syringe Co. PRMKIT  

References

  1. Bahr, M. Live or let die – retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).
  2. Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. Molecular determinants of retinal ganglion cell development, survival, and regeneration. Prog Retin Eye Res. 22, 483-543 (2003).
  3. Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. J Neurobiol. 59, 162-180 (2004).
  4. Weishaupt, J. H., Bahr, M. Degeneration of axotomized retinal ganglion cells as a model for neuronal apoptosis in the central nervous system – molecular death and survival pathways. Restor. Neurol. Neurosci. 19, 1-2 (2001).
  5. Arai-Gaun, S. Heme oxygenase-1 induced in muller cells plays a protective role in retinal ischemia-reperfusion injury in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45, 4226-4232 (2004).
  6. Bainbridge, J. W., Tan, M. H., Ali, R. R. Gene therapy progress and prospects: the eye. Gene Ther. 13, 1191-1197 (2006).
  7. Polo, A. D. i. Prolonged delivery of brain-derived neurotrophic factor by adenovirus-infected Muller cells temporarily rescues injured retinal ganglion cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 3978-3983 (1998).
  8. Herard, A. S. siRNA targeted against amyloid precursor protein impairs synaptic activity in vivo. Neurobiol Aging. 27, 1740-1750 (2006).
  9. Koeberle, P. D., Bahr, M. The upregulation of GLAST-1 is an indirect antiapoptotic mechanism of GDNF and neurturin in the adult CNS. Cell Death Differ. 15, 471-483 (2008).
  10. Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. 125, 903-920 (2004).
  11. Naik, R., Mukhopadhyay, A., Ganguli, M. Gene delivery to the retina: focus on non-viral approaches. Drug Discov Today. 14, 306-315 (2009).
  12. van Adel, B. A. Delivery of ciliary neurotrophic factor via lentiviral-mediated transfer protects axotomized retinal ganglion cells for an extended period of time. Hum Gene Ther. 14, 103-115 (2003).
  13. Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. Adeno-associated viral vectors and the retina. Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).
  14. Allocca, M. AAV-mediated gene transfer for retinal diseases. Expert Opin Biol Ther. 6, 1279-1294 (2006).
  15. Surace, E. M., Auricchio, A. Versatility of AAV vectors for retinal gene transfer. Vision Res. 48, 353-359 (2008).
  16. Garcia-Valenzuela, E. Axon-mediated gene transfer of retinal ganglion cells in vivo. J Neurobiol. 32, 111-122 (1997).
  17. Koeberle, P. D., Wang, Y., Schlichter, L. C. Kv1.1 and Kv1.3 channels contribute to the degeneration of retinal ganglion cells after optic nerve transection in vivo. Cell Death Differ. 17, 134-144 (2010).
  18. Kugler, S. Transduction of axotomized retinal ganglion cells by adenoviral vector administration at the optic nerve stump: an in vivo model system for the inhibition of neuronal apoptotic cell death. Gene Ther. 6, 1759-1767 (1999).
  19. Lingor, P. Down-regulation of apoptosis mediators by RNAi inhibits axotomy-induced retinal ganglion cell death in vivo. Brain. 128, 550-558 (2005).
  20. Leon, S. Lens injury stimulates axon regeneration in the mature rat optic nerve. J Neurosci. 20, 4615-4626 (2000).
  21. Mansour-Robaey, S. Effects of ocular injury and administration of brain-derived neurotrophic factor on survival and regrowth of axotomized retinal ganglion cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 1632-1636 (1994).
  22. D’Onofrio, P. M., Magharious, M. M., Koeberle, P. D. Optic Nerve Transection: A Model of Adult. J Vis Exp. , .

Play Video

Cite This Article
D’Onofrio, P. M., Magharious, M. M., Koeberle, P. D. Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS. J. Vis. Exp. (51), e2261, doi:10.3791/2261 (2011).

View Video