Summary

Methoden voor experimentele manipulaties na Optic Nerve doorsnijding in het zoogdier CZS

Published: May 12, 2011
doi:

Summary

Optic Nerve doorsnijding is een veel gebruikt model van de volwassen CNS verwonding. Dit model is ideaal voor het uitvoeren van een aantal experimentele manipulaties die het netvlies doel wereldwijd of direct de doelstelling van de gewonden neuronale populatie van retinale ganglioncellen.

Abstract

Retinale ganglioncellen (RGC) zijn CNS neuronen die uitvoer visuele informatie van het netvlies naar de hersenen, via de oogzenuw. De oogzenuw kan worden benaderd binnen de baan van het oog en volledig doorsneden (axotomized), het snijden van de axonen van de gehele bevolking RGC. Oogzenuw doorsnijding is een reproduceerbaar model van apoptotische neuronale celdood in de volwassen CZS 1-4. Dit model is vooral aantrekkelijk omdat het glasvocht kamer van het oog werkt als een capsule voor drug delivery aan het netvlies, waardoor experimentele manipulaties via intra-oculaire injectie. De verspreiding van chemische stoffen door het glasvocht vloeistof zorgt ervoor dat ze reageren op de hele RGC bevolking. Virale vectoren, plasmiden of short interfering RNA's (siRNA's) kan ook worden geleverd aan het glasvocht kamer om te infecteren of transfecteren retinale cellen 5-12. De hoge tropisme van adeno-geassocieerd virus (AAV) vectoren is gunstig te richten RGC, met een infectie van bijna 90% van de cellen in de buurt van de injectieplaats 6, 7, 13-15. Bovendien kan RGC selectief worden getransfecteerd door het toepassen van siRNA's, plasmiden, of virale vectoren om het afgesneden uiteinde van de oogzenuw 16-19 of injecteren van vectoren in hun doel de superieure colliculus 10. Dit stelt onderzoekers in staat om apoptotische mechanismen in de benadeelde neuronale populatie bestuderen zonder verstorende effecten op andere omstander neuronen of de omliggende glia. RGC apoptose heeft een karakteristieke tijd-cursus, waarbij celdood wordt vertraagd 3-4 dagen postaxotomy, waarna de cellen snel degenereren. Dit biedt een venster voor experimentele manipulaties gericht tegen routes die betrokken zijn bij apoptose. Manipulaties die direct RGC doel van de doorsneden oogzenuw stomp worden uitgevoerd op het moment van axotomy, onmiddellijk na het snijden van de zenuw. In tegenstelling, wanneer stoffen worden geleverd via een intra-oculaire route, kunnen ze voorafgaand aan de operatie of binnen de eerste 3 dagen na de operatie worden toegediend, voorafgaand aan de initiatie van apoptose in axotomized RGC. In dit artikel tonen we verschillende methoden voor experimentele manipulaties na de oogzenuw doorsnijding.

Protocol

1. Chirurgische techniek Experimenten moeten worden uitgevoerd met aseptische techniek en na het gebruik van dieren protocollen van uw specifieke instelling. Instrumenten en materialen (oplossingen te testen stoffen, tracers, naalden, etc.) in contact komen met levend weefsel moet steriel zijn voor infecties en negatieve effecten te voorkomen dat op het dierenwelzijn en de mogelijke negatieve effecten op de studie. 2. Anesthesie Ratten zullen worden verdoofd met b…

Discussion

Oogzenuw doorsnijding is een zeer reproduceerbare model van de volwassen CZS neuron apoptose. De experimentele manipulaties gedemonstreerd in dit handschrift staan ​​de studie van de mechanismen van RGC apoptose na letsel.

Intra-oculaire injectie zijn nuttig voor de wereldwijde targeting van het netvlies. Deze procedure vergt enige oefening, want het is van levensbelang, niet voor de lens verwonden met de punt van de glazen pipet. Lens schade is aangetoond dat de afgifte van groeifactore…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

PDK wordt ondersteund door een CIHR exploitatiesubsidie ​​(MOP 86523)

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Stereotaxic Frame   Stoelting, Kopf, WPI    
Rat Gas Mask   Stoelting, Kopf, WPI    
Anesthesia System   VetEquip 901806  
Isoflurane (PrAErrane)   Baxter Corp DIN 02225875  
Surgical Microscope   WPI, Zeiss, Leica    
Alcaine Eye Drops   Alcon    
Tears Naturale P.M.   Alcon    
Fine tip Dumont forceps   Fine Science Tools 11252-00  
10 μl Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2”/2)   Hamilton Syringe Co. 80030  
1/16 inch Compression Fittings   Hamilton Syringe Co. 55751-01  
1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing   Supelco, Bellefonte, PA Z226661  
Dual RN Glass Coupler   Hamilton Syringe Co. 55752-01  
Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa   Hamilton Syringe Co. PRMKIT  

References

  1. Bahr, M. Live or let die – retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).
  2. Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. Molecular determinants of retinal ganglion cell development, survival, and regeneration. Prog Retin Eye Res. 22, 483-543 (2003).
  3. Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. J Neurobiol. 59, 162-180 (2004).
  4. Weishaupt, J. H., Bahr, M. Degeneration of axotomized retinal ganglion cells as a model for neuronal apoptosis in the central nervous system – molecular death and survival pathways. Restor. Neurol. Neurosci. 19, 1-2 (2001).
  5. Arai-Gaun, S. Heme oxygenase-1 induced in muller cells plays a protective role in retinal ischemia-reperfusion injury in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45, 4226-4232 (2004).
  6. Bainbridge, J. W., Tan, M. H., Ali, R. R. Gene therapy progress and prospects: the eye. Gene Ther. 13, 1191-1197 (2006).
  7. Polo, A. D. i. Prolonged delivery of brain-derived neurotrophic factor by adenovirus-infected Muller cells temporarily rescues injured retinal ganglion cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 3978-3983 (1998).
  8. Herard, A. S. siRNA targeted against amyloid precursor protein impairs synaptic activity in vivo. Neurobiol Aging. 27, 1740-1750 (2006).
  9. Koeberle, P. D., Bahr, M. The upregulation of GLAST-1 is an indirect antiapoptotic mechanism of GDNF and neurturin in the adult CNS. Cell Death Differ. 15, 471-483 (2008).
  10. Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. 125, 903-920 (2004).
  11. Naik, R., Mukhopadhyay, A., Ganguli, M. Gene delivery to the retina: focus on non-viral approaches. Drug Discov Today. 14, 306-315 (2009).
  12. van Adel, B. A. Delivery of ciliary neurotrophic factor via lentiviral-mediated transfer protects axotomized retinal ganglion cells for an extended period of time. Hum Gene Ther. 14, 103-115 (2003).
  13. Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. Adeno-associated viral vectors and the retina. Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).
  14. Allocca, M. AAV-mediated gene transfer for retinal diseases. Expert Opin Biol Ther. 6, 1279-1294 (2006).
  15. Surace, E. M., Auricchio, A. Versatility of AAV vectors for retinal gene transfer. Vision Res. 48, 353-359 (2008).
  16. Garcia-Valenzuela, E. Axon-mediated gene transfer of retinal ganglion cells in vivo. J Neurobiol. 32, 111-122 (1997).
  17. Koeberle, P. D., Wang, Y., Schlichter, L. C. Kv1.1 and Kv1.3 channels contribute to the degeneration of retinal ganglion cells after optic nerve transection in vivo. Cell Death Differ. 17, 134-144 (2010).
  18. Kugler, S. Transduction of axotomized retinal ganglion cells by adenoviral vector administration at the optic nerve stump: an in vivo model system for the inhibition of neuronal apoptotic cell death. Gene Ther. 6, 1759-1767 (1999).
  19. Lingor, P. Down-regulation of apoptosis mediators by RNAi inhibits axotomy-induced retinal ganglion cell death in vivo. Brain. 128, 550-558 (2005).
  20. Leon, S. Lens injury stimulates axon regeneration in the mature rat optic nerve. J Neurosci. 20, 4615-4626 (2000).
  21. Mansour-Robaey, S. Effects of ocular injury and administration of brain-derived neurotrophic factor on survival and regrowth of axotomized retinal ganglion cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 1632-1636 (1994).
  22. D’Onofrio, P. M., Magharious, M. M., Koeberle, P. D. Optic Nerve Transection: A Model of Adult. J Vis Exp. , .

Play Video

Cite This Article
D’Onofrio, P. M., Magharious, M. M., Koeberle, P. D. Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS. J. Vis. Exp. (51), e2261, doi:10.3791/2261 (2011).

View Video