Summary

Detecção de Atividade Neu1 sialidase em Regulação Toll-like receptor de ativação

Published: September 07, 2010
doi:

Summary

O ensaio sialidase é uma abordagem simples técnica que irá elucidar mecanismo molecular romance (s) de sensores de TLR de infecções microbianas e envolvimento em doenças inflamatórias ao nível do receptor na superfície celular de macrófagos ao vivo.

Abstract

Mamíferos Toll-like receptors (TLRs) são uma família de receptores que reconhecem patógenos padrões moleculares associados. Não são apenas os TLRs sensores crucial da microbiana (por exemplo, vírus, bactérias e parasitas) infecções, eles também desempenham um papel importante na fisiopatologia de doenças infecciosas, doenças inflamatórias e, possivelmente, em doenças auto-imunes. Assim, a intensidade ea duração das respostas TLR contra as doenças infecciosas devem ser rigorosamente controladas. Segue-se que o entendimento a integridade estrutural dos receptores de sensor, suas interações ligante e componentes de sinalização é essencial para a proteção imunológica subseqüentes. Seria também oferecem oportunidades importantes para a modificação de doenças através da manipulação sensor. Embora as vias de sinalização de sensores de TLR estão bem caracterizadas, os parâmetros de controle de interações entre os sensores e seus ligantes ainda permanecem mal definidos. Recentemente, identificou um novo mecanismo de ativação do TLR por seu ligante natural, que não foi observado anteriormente 1,2. Ele sugere que a ativação induzida por ligante TLR é rigidamente controlado por Neu1 ativação sialidase. Temos também informou que Neu1 regule receptores neurotrofina como TRKA TrkB e 3, que envolvem Neu1 e matriz metaloproteinase-9 (MMP-9) cruzada no complexo com os receptores 4. O ensaio sialidase foi inicialmente usado para encontrar um romance ligante thymoquinone, na ativação de Neu4 sialidase na superfície celular de macrófagos, células dendríticas e células fibroblasto via GPCR Gαi proteínas e MMP-9 5. Para os receptores TLR, nossos dados indicam que Neu1 sialidase já está em complexos com receptores TLR-2, -3 e -4, e é induzida mediante ligação do ligando a qualquer receptor. Ativado Neu1 hidrolisa sialidase sialil α-2 ,3-β-ligados galactosyl resíduos distante ligação do ligando para remover impedimento estérico a TLR-4 dimerização, MyD88/TLR4 recrutamento complexo, NFkB ativação e respostas pró-inflamatórias da célula. Em um relatório de colaboração, sialidase Neu1 foi mostrado para regular a fagocitose em macrófagos 6. Tomados em conjunto, o ensaio sialidase nos forneceu insights poderosos para os mecanismos moleculares do ligante induzida por ativação do receptor. Embora a relação exata entre Neu1 sialidase e ativação de TLR, receptores Trk ainda não foi completamente elucidado, isso representaria uma nova abordagem ou pioneira de vias de regulação celular.

Protocol

1. Ressuscitando macrófagos Congelados Antes de ressuscitar células congeladas do freezer -80 ° C, é preciso preparar meio de cultura usando estéril filtrado Médio Modified Dulbecco Águia (DMEM) suplementado com 10% soro fetal bovino (FBS) e 5 mg / mL de plasmocin. Plasmocin é uma solução de antibiótico utilizado em nossa pesquisa para eliminar e evitar a contaminação por micoplasma em culturas de células. Para um frasco de células congeladas, acrescenta um 4 mL, 1 mL do meio de cultu…

Discussion

Utilizando o teste recentemente desenvolvido para detectar atividade de sialidase em células macrófago vivo 2, usamos essa tecnologia para detectar atividade de sialidase em ligante induzida por atividade sialidase em viver BMC-2 macrófagos de uma forma dependente da dose, bem como em viver DC-2.4 células dendríticas , HEK-TLR4/MD2, HEK293, SP1 nas células mamárias adenocarcinoma, WT humanos e 1140F01 e WG0544 tipo I fibroblastos sialidose. Inibidores da neuraminidase, como o Tamiflu (fosfato de oselta…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Apoio parcial por doações para MRS é de Ciências Naturais e Pesquisa de Engenharia Council of Canada (NSERC), o Harry Botterell Foundation for Neuroscience Research, ARC, eo Garfield Research Kelly Cardiovascular e Fundo de Desenvolvimento. SRA é um receptor da Rainha do Prêmio de Pesquisa da Universidade e do Robert J. Wilson Fellowship. PJ é um receptor de Prêmio de Pós-Graduação da rainha e do Robert J. Wilson Fellowship. AG e SA são os destinatários do Prêmio de Pós-Graduação da Rainha. SF foi o ganhador da Bolsa de Pós-Graduação em Ontario Ciência e Tecnologia (OGSST). AG é o destinatário da Rainha Franklin Bolsa de Pós-Graduação Bracken. SA é o destinatário da Rainha RS Bolsa de Pós-Graduação McLaughlin.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
DMEM   Gibco, Rockville, MD    
4-MUNANA   Biosynth International Inc., Itasca, IL, USA    
Fetal calf serum   HyClone, Logan, Utah, USA    
DakoCytomation, Fluorescent Mounting Media   DAKO North America, Inc., Carpintenia, CA S3023 15 mL
Tamiflu (Oseltamivir Phosphate)   Hoffman La Roche    

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Cite This Article
Amith, S. R., Jayanth, P., Finlay, T., Franchuk, S., Gilmour, A., Abdulkhalek, S., Szewczuk, M. R. Detection of Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation. J. Vis. Exp. (43), e2142, doi:10.3791/2142 (2010).

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