כאן אנו מציגים את הזריקה תוך גולגולתי של וקטורים AAV תיוג הניאון של גליה נוירונים בקליפת המוח הראייתית.
Abstract
הזרקה תוך גולגולתי של וקטורים ויראליים שהונדסו חלבון פלואורסצנטי היא טכניקה תיוג תכליתי עבור להדמיה של תת מסוימים של תאים באזורים שונים במוח הן in vivo ו בסעיפים המוח. בניגוד הזרקה של צבעי ניאון, תיוג ויראלי מציעה המיקוד של סוגי תאים בודדים הוא זול יותר זמן רב יותר מאשר הקמת קווי עכבר מהונדס. בטכניקה זו, adeno הקשורים וקטור ויראלי (AAV) מוזרק intracranially באמצעות קואורדינטות stereotaxic, micropipette ואת משאבת אוטומטיות למסירה מדויקת של AAV לאזור הרצוי עם נזק מינימלי לרקמות שמסביב. פרמטרים של הזרקה ניתן להתאים את הניסויים הפרט על ידי התאמת גיל החיה בקצב הזרקה, מיקום הזריקה, עוצמת הזריקה, של הזרקה, AAV סרוטיפ ואת האמרגן נהיגה ביטוי גנים. בהתאם לתנאי הנבחר, virally-Induced ביטוי transgene יכול לאפשר ויזואליזציה של קבוצות של תאים, תאים בודדים או תהליכים תאיים בסדר, עד לרמה של הקוצים הדנדריטים. הניסוי שמוצג כאן מציג זריקה של AAV פעמיים תקועים לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק עבור תיוג של גליה נוירונים בקליפת המוח החזותית העיקרי בעכבר.
Protocol
1. וירוס טיפול ואחסון הגנה נכונה טכניקות הטיפול יש לבחור בהתבסס על רמת בטיחות ביולוגית של הנגיף לשמש. שיטות אלה ניתן למצוא biosafety במהדורה מיקרוביולוגי ביו 5 th מעבדות, באתר האינטרנט של ה-CDC ( <a href="http://www.cdc.gov/od/OHS/bios…
Discussion
Virally בתיווך משלוח גן בעל פוטנציאל גדול למחקר של תהליכים נוירולוגיות וטיפול בהפרעות במוח 1,2,3. צדדיות הגדול של טכניקה זו יכולה גם להיות מנוצלת כדי fluorescently תווית תאים הדמיה הן במבחנה in vivo4. כאן אנו מדגימים נוהל מפורט עבור התמרה של נוירונים גליה בעכבר קלי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו התאפשרה על ידי מענק מ-NIH (EY012977), פרס קריירה במדעי ביו מן Wellcome בורוז קרן, קרן וייטהול, קרן סלואן (AKM).
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Stoelting Mouse and Neonatal Rat Adaptor
Stoelting
51625
Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted
Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm
Fine Science Tools
14084-08
Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved
Fine Science Tools
11152-10
Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled
Fine Science Tools
11251-35
Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy
Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm
Fine Science Tools
11000-12
Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece
Ram Products, Inc.
TECH2000ON/OFF
Dental drill
Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter
Fine Science Tools
19008-14
Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul
VWR International/ Drummond
5-000-1001 or 53480-287
Mineral oil
VWR International
29447-338
Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed)
World Precision Instruments, Inc.
M3301-M3-R
Used for determining stereotaxic co-ordinates
UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller
World Precision Instruments, Inc.
UMP3-1
Sutures
VWR International
95056-952
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller
Sutter Instruments
P-97
Tobradex
Available from your institution’s veterinary services