Часть 1: RNAi в 384 луночных Стандартизация реагентов, используемых для скрининга является существенным. Мы проверяем отдельным партиям СМИ Шнайдера, эмбриональной телячьей сыворотки, и окрашивания реагентов. Тогда мы аликвоту и использовать тот же многое для всего экрана. Для любого анализа, то лучше проверить несколько различных клеточных линий, чтобы определить, какие наиболее поддаются ваши биологические считывания. Обычно мы используем S2-д.т.н. линии. Расти дрозофилы клетки при 25 ° С в средствах массовой информации полный Шнайдера. Шнайдера СМИ 10% тепла инактивированной FBS 1X L-глютамин 1X Pen / стрептококк антибиотиков Дрозофилы клетки являются полу-сторонника и пассировать без трипсинизации каждые четыре дня с помощью пипетки клетки с колбами и разбавления клетки 1:10 в свежем колбу. Клетки должны быть в лог-фазе для экспериментов. Пластины к пластине и изо дня в день изменчивости сведены к минимуму за счет использования автоматизированных наливных для всех жидких дополнений в мульти-луночных планшетах. Мы используем WellMate (Matrix). Подготовка WellMate труб. Спрей капот и WellMate с 70% этанола. Удалите трубку от упаковки и спрей с 70% этанола. Вставьте кассету в трубку выдачи позицию по WellMate. Премьер трубка с 25 мл 70% этанола. Стерилизовать трубы в этаноле в течение 15 минут, после чего премьер с еще 25 мл этанола. Промойте трубы от грунтовки с 50 мл стерильного PBS. Выбить клетки из колбы и считать. Гранул клеток так, что у вас есть 25% больше, чем нужно (300xg, 5 мин). Число клеток посеяны на скважину должны быть оптимизированы в соответствии с анализа длины. При проведении автоматизированного анализа изображения, одного монослоя, без комков ячейка идеально подходит для сегментации изображения. Ресуспендируют гранулированных клеток сыворотки среде Шнайдера на 1.7×10 6 клеток / мл. Мы выполняем экрана в 384 луночных предварительно аликвоты с коммерчески доступные библиотеки дсРНК в концентрации 250ng/well. Несколько скважин каждой пластины остаются пустыми для элементов управления, которые добавляются вручную. Мы используем дсРНК для люциферазы в качестве отрицательного контроля. Мы используем дсРНК против тема (ДиПД) в качестве контроля для надежной RNAi. Уложи этого антиапоптотического фактор приводит к драматической гибели клеток и быстрый визуальный способ оценить качество сбить. Наконец, мы используем дсРНК против вирусного репортера, в данном случае бета-galacosidase, в качестве положительного контроля для подтверждения того, что мы можем подавлять вирусную инфекцию с помощью нашего анализа считывания. Если кровянистые выделения дсРНК в пластине в момент клетка посева, аликвоту 1 мкл дсРНК в угол и для упрощения визуализации, то центрифуги дсРНК на нижней части скважины (300xg, 1 мин) перед добавлением клеток. Используйте WellMate добавить 10 мкл клетки полученного ранее в каждую лунку. Спиновые клеток на пластинах путем центрифугирования 300xg, 1 мин. Инкубируйте в 25 ° C инкубаторе в течение 45 минут. Добавьте 20 мкл полный СМИ Шнайдера и центрифуги 300xg, 1 мин. Место пластин в увлажненные контейнеры Tupperware выстроились с водянистыми бумажные полотенца. Объем 384 также мала, таким образом, испарение может иметь большое влияние на биологию, которая в свою очередь может привести к искусственной изменения в чтение выходы края скважин. Чтобы преодолеть это, плиты должны быть сохранены в условиях высокой влажности. Инкубируйте в течение трех дней, чтобы обеспечить надежную нокдаун. Существует не нужно менять носитель или открытых увлажненных контейнеров в это время. Часть 2: Заражение с вирус коровьей оспы Стерилизовать многоканальный аспиратор в Quatricide в течение 15 минут, затем промыть в 70% этанола. Подготовка WellMate как описано выше. Подготовка медиа Шнайдера с 2% ЭТС-инфекции путем разбавления полный медиа 1:5 в сыворотке свободных средств массовой информации. Фильтры сырой запас вируса через шприц 0,8 мкм фильтр для удаления клеточных остатков или использования очищенного вируса. Развести вирус коровьей оспы в 2% СМИ сыворотке Шнайдера получить множественность заражения (МВД) 2. Удалить из PBS WellMate труб, и премьер-разбавленным вирус, пока трубка не содержит пузырьков воздуха. Используйте стерилизованные многоканальный аспиратор и вакуумный коллектор, чтобы мягко удалить средств массовой информации из пластин дсРНК-обработанных клеток дрозофилы. Внесите 30 мкл вируса на одну скважину на тарелки использованием WellMate. Центрифуга пластин 1 минуту при 300xg. Стерилизовать WellMate труб. Премьер с 25 мл 10% Блеяч, подождите 10 минут, и премьер-с еще 25 мл 10% гипохлоритом натрия. Премьер трубка с 50 мл воды, а затем на 50 мл 70% этанола. Вернуться трубку к его упаковке. Вернуться пластин увлажненной контейнере Tupperware. Инкубировать при 25 ° С в течение 48 часов. Часть 3: Окрашивание Плиты Fix пластин в 15 мкл 4% формальдегида / PBS в течение 10 минут. Жидкость удаляется с помощью многоканального аспиратор и вакуумного многообразия на каждом шагу. Как только пластины были исправлены, стерильные оборудование и реактивы больше нет необходимости. Удалить фиксировать и использовать WellMate добавить 30 мкл PBST (PBS + 0,1% Triton-X). Инкубируйте 10 минут и повторите упражнение. Эксплуатация WellMate, как описано выше, за исключением трубы не должны быть стерилизованы. Для обнаружения инфекции вакцины мы используем β-галактозидазы репортер обусловлен ранний / поздний промотор вакцины. Удалите жидкость и инкубировать клетки в блоке (PBST с 2% BSA) в течение 10 минут. Развести первичных антител в блок, удалить жидкость и добавить 15 мкл антител в каждую лунку использовании многоканальных повторить пипетки (Matrix). Спином вниз пластин (300xg, 1 мин), накрыть ясно стикер, и инкубировать при температуре 4 ° С в течение ночи. Удаление первичного антитела, а также использовать WellMate мыть скважин в PBST 3 раза по 10 минут. Развести флуоресцентно меченых вторичных антител (FITC) и ядерных пятном в блок, и добавить 15 мкл для скважин с помощью многоканальной пипетки повторить. Инкубируйте пластин 1 час при комнатной температуре в защищенном от света месте. Вымойте скважин в PBST 3 раза по 10 минут использования WellMate. Печать пластины с четко наклейку, накройте крышкой и хранить при 4 ° С до трех недель. Часть 4: Работа с изображениями и анализ изображений Использование автоматизированного микроскопа при 20-кратным увеличением изображения на пластинах. Захват изображений от общего числа ядер (DAPI) и инфицированных клеток (FITC). Оптимизация времени экспозиции для каждого канала в отдельности, чтобы максимизировать динамический диапазон. Тонкая настройка функции автоматического фокуса, принимая стек Z изображений, расположенных 1 мкм друг от друга, которые охватывают самолеты выше и ниже ожидаемого плоскости фокуса. После оптимальной фокальной плоскости находится, регулировать настройки автофокуса соответственно. Изображение всей пластинки, захватив не менее трех изображений в хорошо в обоих Hoechst канал (DAPI) и вирус канал (FITC). Выберите сайты из разных регионов внутри одной скважины с целью захвата изображения, которые представляют также целого. Используйте MetaXpress программное обеспечение для записи журнала в сегменте изображения и использовать модули ядра графа для расчета общего количества клеток положительные для ядерных окрашивания (всего клеток) и инфекции (FITC) для каждой пластины. Рассчитать процент инфекции (100 * FITC положительный / общего числа клеток) и журнал преобразования. Чтобы определить кандидатов мы используем надежные оценка Z основываться на средней и межквартильный размах каждой пластины. Этот метод не чувствителен к выбросам и несимметричные данных, и таким образом обеспечивает большую мощность в определении даже слабые или умеренные хитов 10. Для каждой пластины, среднее вычитается из лог-преобразованных данных. Затем полученные значения делятся на 0,74 раза межквартильный диапазон (разница между значениями 75-й процентили и 25-й процентиль). 0,74 фактор используется для аппроксимации стандартное нормальное распределение. Надежная оценка Z является мерой расстояния в стандартных отклонений от медианы пластины. Например, надежная Z-2 балла указывает% заражение также составляет ~ 2 стандартных отклонения от средней пластины или р <0,05. Анализ количества клеток для выявления цитотоксических кандидатов. Рассчитать надежная оценка Z ядерного рассчитывает. Кандидаты с надежной Z <-2 в двух экземплярах экраны считаются цитотоксическими. Уэллс, которые имеют надежные оценка Z на процент заражения> 2 или <-2 в двух экземплярах, экраны (р <0,0025) без цитотоксичности считаются потенциальными кандидатами от основного экрана. Положительный кандидатов проверяются с использованием независимых реагентов. dsRNAs генерируются против генов интерес из другого региона мРНК и протестированы как указано выше. Те гены, для которых два независимых dsRNAs имеют одинаковый фенотип может рассматриваться для дальнейшего изучения. Часть 5: Представитель Изображения и интерпретация инфекции Рисунок 1. Неинфицированные скважин не показывают окрашивание на белки вируса коровьей оспы, а также представитель инфицированных содержит клетки окрашивания положительным для вакцинного выраженного бета-галактозидазы (βgal) белка, измеренная с помощью иммунофлуоресценции микроскопии.Вирус = зеленый, синий = ядер. Рисунок 2. Автоматизированное программное обеспечение для анализа изображений количественно инфекции у каждого изображения, используя параметры, заданные пользователем. В представителю изображения, общее количество клеточных ядер и число клеток, экспрессирующих антиген вирусного подсчитываются в зависимости от размера и интенсивности окрашивания выше локального окрашивания фона. Рисунок 3. Нокдаун нити (ДиПД) выступает в качестве положительного контроля для надежного разрушения РНК-интерференции генов-мишеней. Нокдаун этого антиапоптотического фактора приводит к драматической гибели клеток. Ядер = синий. Рисунок 4. Нокдаун люциферазы служит в качестве отрицательного контроля за влияние двухцепочечной РНК лечение инфекции. Истощение люциферазы не влияет на инфекции по сравнению с клетками не лечить. Вирус = зеленый, синий = ядер. Рисунок 5. Нокдаун βgal белок служит в качестве положительного контроля для сокращения инфекции, так как анализ использует βgal белка, как зачитал инфекции. Истощение βgal приводит к уменьшению доли инфицированных клеток. Вирус = зеленый, синий = ядер. Рисунок 6. Нокдаун клеточных факторов Rab5 приводит к уменьшению доли инфицированных клеток. С Rab5, как известно, участвуют в эндоцитоз, вероятно, этот фактор вносит свой вклад в запись вируса коровьей оспы. Это представляет пример выброс с экрана. Вирус = зеленый, синий = ядер.