ويمكن تحديد العوامل المضيفة المشاركة في رواية عدوى فيروسية من خلال فقدان الجينوم على نطاق خلية مقرها الفحص رني الدالة. A<em> ذبابة الفاكهة</em> نموذج خلية ثقافة قابلة خاصة لهذا النهج نظرا لسهولة وكفاءة رني. هنا علينا أن نظهر هذه التقنية باستخدام<em> الوقس</em> فيروس كمثال على ذلك.
مسببات الأمراض الفيروسية وتمثل تهديدا كبيرا الصحة العامة ، ليس فقط يمكن أن الفيروسات التي تسبب الأوبئة الطبيعية من الأمراض التي تصيب البشر ، ولكن احتمال استخدامها في الإرهاب البيولوجي هو أيضا مصدر قلق. فهم أفضل للعوامل العدوى الخلوية التي أثر من شأنه أن يسهل تطوير العلاجات التي تشتد الحاجة إليها. وقد أدت التطورات الحديثة في تكنولوجيا الحمض النووي الريبي (رني) التدخل إلى جانب تسلسل الجينوم الكامل عدة من الكائنات الحية على الاستفادة المثلى من الجينوم على نطاق خلية مقرها الخسارة من وظيفة الشاشات. ذبابة الفاكهة خلايا قابلة خاصة إلى الجينوم النطاق بسبب الشاشات سهولة وكفاءة رني في هذا النظام 1. الأهم من ذلك ، يمكن لمجموعة واسعة من فيروسات تصيب خلايا ذبابة الفاكهة ، بما في ذلك عدد من الفيروسات الثدييات ذات الأهمية الطبية والزراعية 2،3،4. وقد حددت السابقة شاشات رني في ذبابة الفاكهة العوامل المضيفة التي مطلوبة من أجل الخطوات المختلفة في عدوى الفيروس بما في ذلك الدخول ، والترجمة والنسخ RNA 5. وعلاوة على ذلك ، فإن العديد من العوامل الخلوية اللازمة لتكاثر الفيروس في الخلية ثقافة ذبابة الفاكهة تحد أيضا في الخلايا البشرية المصابة بتلك الفيروسات 4،6،7،8 ، 9. ولذلك ، وتحديد العوامل المضيفة يختارهم خلال عدوى فيروسية يعرض أهدافا جديدة لعلاجات مضادة للفيروسات. هنا نقدم بروتوكول معمم للشاشة رني الإنتاجية العالية لتحديد العوامل الخلوية العاملة في العدوى الفيروسية ، وذلك باستخدام فيروس الوقس كمثال على ذلك.
الجينوم على نطاق رني الفرز في ذبابة الفاكهة يوفر طريقة قوية وفعالة للنظر في المكون الخلوية من عدوى فيروسية. وهناك عدد من فيروسات تصيب خلايا الثدييات ذبابة الفاكهة ، والتي يمكن استخدامها لتحديد مكونات استجابة المضيف المناعية الذاتية ، والعوامل اللازمة لاستضافة البروتين تكاثر الفيروس التي قد تمثل أهداف علاجية جديدة. قبل تنفيذ الشاشة ، يجب أن يكون الفحص الأمثل بعناية لنوع من الخلايا ، وعدد الخلايا ، ومستوى الإصابة ، ويجب أن تسيطر عليها بشكل جيد ، بما في ذلك سواء كانت إيجابية أو سلبية الفيروسية والأهداف الخلوية 11. فمن المهم لضمان ما يكفي من الفصل بين الضوابط الإيجابية والسلبية قبل الفرز لزيادة النطاق الديناميكي للمقايسة. مرة واحدة وقد تم تنفيذ الشاشة ، ويمكن تقسيمها إلى فئات وظيفية المرشحين لتحديد الآليات التي تسهم في إصابة المضيف. للبحث عن الفيروسات مثل الثدييات الوقس ، ينبغي تحديد مساهمة homologs الثدييات التي كتبها رني كجزء من التحليل الثانوية. أخذت معا ، وهذه طرق الفحص قوية تسمح لنا لاكتساب نظرة ثاقبة الآليات المعقدة التي تتفاعل مع خلايا الفيروسات التي تستضيفهم.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من NIAID (R01AI074951 ، U54AI057168) والجينوم بن حدود معهد لSC ؛ من المعاهد الوطنية للصحة لT32HG000046 TSM ؛ من المعاهد الوطنية للصحة وT32GM07229 T32AI007324 لLRS.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Cell culture | ||||
Schneider’s media | GIBCO | 11720 | ||
GlutaMAX 100X | GIBCO | 35050 | ||
Penicillin/streptomycin (pen/strep) | GIBCO | 15140 | ||
Fetal Bovine Serum (FBS) | SIGMA | F6178 | ||
Screening | ||||
Genome-wide dsRNA library | Ambion | |||
384 well plates, black with clear bottom | Corning | 3712 | ||
Aluminum seals | Corning | 6569 | ||
Clear seals | Denville | B1212-4 | ||
Well Mate | Matrix | 201-10001 | ||
24 pin manifold | Drummond | 3-000-101 | ||
Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | ||
Fluorescently-labeled secondary antibodies | Invitrogen | |||
ImageXpressMicro automated microscope | Molecular Devices | |||
MetaXpress image analysis software | Molecular Devices |