DNAフラグメントをElectroeluting

Summary

この手順では、高収率でDNA断片の精製を可能にする。

Abstract

精製されたDNA断片は、分子生物学で異なる目的で使用されますと、それらはいくつかの手順によって調製することができる。それらのほとんどは、目的のバンドを分離するために、DNA断片の前の電気泳動を必要とする。その後、このバンドは、アガロースまたはアクリルアミドゲルから切り出し、いずれかの方法で精製さ：、DEAE -セルロース膜、ガラスまたはシリカ粒子から結合および溶出は、"メソッドを粉砕し、ソーク"、非常に多くの場合、電気溶出したり、高価な商用の精製キット。このように、方法を選択すると、実験室で使用可能かどうかを主に依存します。電気溶出の手順では、1つは、多数のアプリケーション（シーケンス、放射能標識、酵素的制限、酵素的修飾、クローニングなど）で使用される非常にきれいなDNAを精製することができます。この手順では、DNAバンドを含むelectroeluterのサンプルウェルにアガロースまたはアクリルアミドのスライスを配置することで構成され、その後現在の適用は、アガロースを残すためにDNA断片を行いますので、エタノール沈殿により、後で回収されるクッションの塩で閉じ込められる。

Protocol

精製される、目的のDNA断片を選択するために、これらは、アガロースまたはアクリルアミドゲル中で解決されるべきである1時間120ボルトで0.5 × TBEバッファー（トリスホウ酸、EDTA）を用いて電気泳動により臭化エチジウムで染色したゲル。このためには、〜700 ngの前にNdeIとHindIIIで消化したプラスミドpProEx – GdMre11S（6000 – bp）を900 bpの断片を（断片のプ​​ラスミドおよび84 ngの560 ng）を解放するために使用されていました。 electroeluterタンク（図1）は中間台地上にこぼさないでの世話をして同様に中間台地の両側に分布する0.5X TBEで埋めなくてはなりません。 選択されたバンド（またはバンド）をゲルから切り出し、そしてできるだけ近いVチャネル（ウェルあたりつのスライス）にとして、試料室に配置されます。実行中のバッファは、各チャンバーに追加する必要があります。ゲルスライスをカバーするだけの十分な。 使用される各Vチャネルが捕捉された任意の気泡を除去するためにパスツールピペットを用いてフラッシュする必要があります。 その後、10 M NH 4酢酸100μlのは、（ちょうど足りるだけのそれに色を付けるために、ブロモフェノールブルーの少量が追加される可視化を容易にするために）優しくVチャネルの内部に追加されます。 高塩クッションのいずれかの再懸濁を防止するために蓋を静かに閉じる必要があります。 電気溶出を25分間100ボルトで開始されます。 electrolutionは、400 ulを完了すると4℃（DNAの回収を向上させるために推奨）V -チャネルから削除し、冷エタノールとグリコーゲンの2容量を析出させる遠心チューブ内に配置されます℃で1時間または一晩Cを。 20分間遠心分離、上清を除去し、70％エタノールで洗う。 乾燥管とOD 260 nmでDNAを定量化する。 得られた回収は75％（63 ngは84 ngのがV -チャネル上に配置されたときに復旧）であった。 図1。Electroeluter図。カソードは、タンクのそれぞれの側に示されているAnod、（黒い四角として示される）スライスしたゲルに含まれるDNAは、その負電荷により陰極に向かって移行されます。それは塩のクッションの中に閉じ込め（逆黒い三角形として表される）V -チャネルに配置されます。

Discussion

テストの実行時間は1時間まで20キロバイト50分までフラグメントのために、通常、フラグメントのサイズに大きく左右される小さな断片のために10分ごとに監視してUV光が通過するフラグメントを防止するために必要とされる一方、十分です。塩のクッション、結果的に回復を減少させる陽極バッファー槽に。あなたが100ボルトで、電源装置を設定すると、現在少なくとも10のMAMPあることを確認することが重要です。 DNAバンドは、UV -ハンドランプを使用して監視し、これをゲルスライスを放棄したことを検出することができます。クッションの塩は、3 M酢酸ナトリウムで行うこともできます。

この手順では、良好な回収率（〜80％）で異なるサイズのDNAまたはRNA断片の精製は修飾酵素などによって処理、制限酵素による消化、放射性標識することができます

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
NdeI		New England Biolabs	R0111L
HindIII		New England Biolabs	R0104L
NH4 acetate		JTBaker	0596
agarose		Invitrogen	15510-027
Biophotometer		Eppendorf	6131 000 020
Electroeluter		IBI	UEA CAT 46000