Electroeluting的DNA碎片

Summary

此过程允许高产纯化的DNA片段。

Abstract

在分子生物学，纯化后的DNA片段用于不同的目的，他们可以通过以下几个步骤的准备。他们大多需要以前的DNA片段的电泳以独立乐队的利益。然后，这个乐队是切除了从琼脂糖或丙烯酰胺凝胶，并用纯化之一：具有约束力，从玻璃或石英颗粒，DEAE -纤维素膜，洗脱“粉碎和浸泡法”，电泳或非常往往是昂贵的商业纯化试剂盒。因此，选择一种方法，主要将取决于什么是可在实验室。电泳程序允许一个净化非常干净的DNA，在大量的应用（放射性标记，测序，限制酶，酶的修饰，克隆等）使用。这个过程包括在把DNA带含有样品井electroeluter，然后应用当前的琼脂糖或丙烯酰胺片的DNA片段离开琼脂糖，因此被困在一个缓冲盐乙醇沉淀后予以追缴。

Protocol

为了得到净化的兴趣选择的D​​NA片段，这些应解决的琼脂糖或丙烯酰胺凝胶，凝胶用溴化乙锭染色使用0.5X TBE缓冲液（三硼酸盐，EDTA）电泳，在120伏1小时。对于这一点，以前〜700质粒pProEx GdMre11S吴（6000 – BP）与NdeI和HindIII消化，是用来释放一个900 bp的片段（560片段的质粒和84吴吴）。 electroeluter坦克（图1）应填写与同样分布在高原中的每一​​侧的0.5X TBE考虑到中期高原照顾不泄漏。 所选波段（或波段）的凝胶切出，并尽可能靠近V通道（片，每孔）放置在样品室。运行缓冲液应该被添加到每个分庭;只够盖的凝胶片。 每个通道使用，必须刷新巴斯德吸管，以消除任何气泡被困。 然后10米NH 4醋酸100 UL（方便的可视化，加入少量的溴酚蓝，刚够颜色）轻轻加入V通道内。 应关闭盖子，轻轻地，以防止任何再悬浮的高盐缓冲。 电泳是在100伏25分钟开始。 当electrolution完成后，400 UL，从V -通道，并在离心管置于2卷，冷乙醇和糖原（建议提高DNA回收）在4 ° C沉淀1个小时或过夜。 离心20分钟，去除上清液，并用70％乙醇。 干管和量化外径260纳米的DNA。 回收率为75％（63纳克恢复时，84纳克被放置在V -通道）。 图1，Electroeluter图。 Anod一个阴极上标明每个侧槽，切片凝胶中的DNA（作为一个黑色的方形所示）将移向阴极，由于其负电荷。然后，将被困在盐缓冲位于V型通道（作为一个倒置的黑色三角形表示）。

Discussion

运行的时间将取决于高度上的片段大小，通常为片段高达20 KB 50分钟到1小时就足够了，而小碎片的监测，每10分钟的紫外灯是需要防止的片段，经过盐垫，从而减少恢复正极缓冲室。重要的是要确保，当您设定在100伏的电源，是目前至少有10 MAMP。 DNA条带，使用的紫外线灯，可以监测和检测时放弃的凝胶片。坐垫也可以带3米的钠醋酸盐。

此过程允许将放射性恢复良好（〜80％）的大小不同的DNA或RNA片段的纯化，限制性内切酶消化，加工修饰酶，等

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
NdeI		New England Biolabs	R0111L
HindIII		New England Biolabs	R0104L
NH4 acetate		JTBaker	0596
agarose		Invitrogen	15510-027
Biophotometer		Eppendorf	6131 000 020
Electroeluter		IBI	UEA CAT 46000