Biz beyin bölümlerinin kesit alma fareler, kaldırma ve kesit beynin yanı sıra immunoperoksidaz boyama, reçine gömme ve ultra ince transcardiac perfüzyon için bir protokol tanımlamaktadır. Bu prosedürlerin tamamlanmasının ardından, ile immunohistokimyasal malzeme transmisyon elektron mikroskobu ile incelenmesi için hazırdır.
Transmisyon elektron mikroskobu (TEM), merkezi sinir sistemi, mikroglia, oligodendrocytic astrositik ve nöronal hücre içi bölmeleri (dendrit dendritik omurga, akson, akson terminali, perikaryon) yanı sıra, bunların hücre içi organelleri ve hücre iskeletinin görselleştirmek için son derece yararlı yüksek uzaysal çözünürlük. Olarak sunulan; TEM ile birlikte, ön gömme immünsitokimya birkaç ayırt edici özellikleri ve kimlik kriterleri (örneğin, mikroglia perikarya ve süreçleri, mikroglia özel işaretleyici Iba1 (iyonize kalsiyum bağlama adaptörü molekülü 1 karşı bir antikor kullanarak hücresel elemanların ayrımcılık sağlar burada)), nörotransmitter olarak hücresel elementler içeriği (örneğin, serotonerjik) ve ultrastrüktürel çözünür ve membrana bağlı proteinler lokalizasyonu (örneğin, 5 HT1A ve EphA4 reseptörler) belirlenmesi. Burada, akrolein fiksatörü, beyin bölümlerinin kaldırılması kesit ve kesit beynin yanı sıra immunoperoksidaz-diaminobenzidin (DAB), boyama, reçine gömme ve ultra ince fareler transcardiac perfüzyon için bir protokol açıklar. Ile immunohistokimyasal malzeme bu prosedürlerin tamamlanmasının ardından, TEM ile inceleme için hazırdır. Titizlikle yapılan zaman, bu tekniğin optimal ultrastrüktürel koruma ve immünositokimyasal algılama arasında mükemmel bir denge sağlar.
Burada, en iyi ultrastrüktürel korunması ve prosedürleri titizlikle yapılmaktadır immünositokimyasal algılama arasında mükemmel bir denge sağlar immunoelectron mikroskopi için fare beyin doku hazırlanması için bir protokol tanımlanmıştır.
TEM ile birlikte, bu yöntem, birkaç ayırt edici özellikleri ve kimlik kriterleri ile hücresel öğeleri ayırt etmek sağlar. Özellikle, Iba1 immunoperoksidaz-DAB boyama neuropil içinde mikroglia perikarya ve süreçleri tanımlama…
The authors have nothing to disclose.
Biz, teknik yardım için Rochester Tıp Merkezi Üniversitesi'nden Elektron Mikroskobu Araştırma Core Tesisleri'nde bir peristaltik pompa ve vibratome kullanımının yanı sıra, Karen L. Bentley ve Gayle Schneider Shao-Ming Lu ve Harris A. Gelbard teşekkür ederim. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, (EY019277), Whitehall Vakfı, Burroughs Wellcome Fonu ve AKM için Alfred P. Sloan Vakfı hibe tarafından finanse edildi. M.-È.T. Viyana de la recherche tr santé du Québec (FRSQ) doktora sonrası eğitim ödülü tarafından finanse edilmektedir.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Sodium pentobarbital (Nembutal) | Ovation Pharmaceuticals | |||
Filter paper 315 24 cm | VWR | 28331-081 | ||
*Acrolein purum (≥95%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 01680 | ||
Sodium borohydride (≥98%) | Sigma-Aldrich (Aldrich) | 452173 | ||
*Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%) | Sigma-Aldrich | 441244 | ||
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | ||
Rabbit anti-Iba1 primary antibody | Wako | 019-19741 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 111-066-046 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
Peroxidase-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
*Osmium tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Light sensitive | |
Propylene oxide (≥99%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 82325 | ||
Polypropylene disposable beakers (50 mL) | Fisher | 01-291-10 | ||
Aluminium weigh dishes (70 mm) | Fisher | NC9261784 | ||
Durcupan epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14040 | ||
Embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70907 | ||
DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich (BioChemika) | 44581 | ||
Gelatin subbed slides | VWR | 100241-864 | ||
ACLAR embedding films (7.8 mm) | Electron Microscopy Sciences | 50425 | ||
Capsule mold | Electron microscopy Sciences | 70150 | ||
High-performance super glue | Corporate Express | LOC30379 | ||
Perfect loop for ultra thin sections | Electron Microscopy Sciences | 70944 | ||
Superfrost slides | Fisher | 22-178-277 | ||
Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm) | Diatome | |||
Gelatin from cold water fish skin (~45%) | Sigma-Aldrich (Sigma) | G7765 |
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly.