Hazırlanması Drosophila Işık Mikroskopi S2 hücreleri
Summary
Drosophila Schneider (S2) hücreleri genlerin keşfi ve fonksiyonel analiz için giderek daha popüler bir sistem. Amacımız giderek daha önemli bir deneysel sistem S2 hücrelerin mikroskobik teknikler bazı tanımlamak için.
Abstract
Ideal bir deney sistemi, çeşitli teknikler için uygun bakımı için ucuz ve kolay olacağını ve geniş bir literatür ve genom dizisi veritabanı tarafından desteklenen olurdu. Kültüre Drosophila S2 hücreleri, ilişkisiz 20-24 saat eski embriyolar 1 ürün, bütün bu özelliklere sahip. Sonuç olarak, S2 hücreler moleküler sürecin bileşenleri veya ilgi mekanizması kodlayan genlerin keşfi de dahil olmak üzere hücresel süreçlerin analizi için son derece uygundur. Onların yardımcı programı en çok sorumlu olan S2 hücreleri canlı veya sabit olarak korunur kolaylığı, çift iplikli RNA-aracılı (ds) girişim (RNAi), kendine has duyarlılığı ve floresan mikroskopi için tractability hücreleri.
S2 hücreleri, ucuz, piyasada bulunan, tam olarak tanımlanmış, serum ücretsiz medya 2 çok sayıda dahil olmak üzere, çeşitli medya yetiştirilebilir . Buna ek olarak, 21-24 ° C'de en iyi ve hızlı bir şekilde büyür ve konteynerlerin çeşitli kültür olabilir. Memeli hücrelerinin aksine, S2 hücrelerinin düzenli bir atmosfer gerektirmez, ancak bunun yerine normal hava ile iyi ve hatta kapalı şişelerde muhafaza edilebilir.
S2 hücreleri RNAi kolaylığı tamamlayan faz ya da sabit veya canlı hücrelerin floresan mikroskobu ile deneysel olarak indüklenmiş fenotipleri kolayca analiz yeteneği. S2 hücreleri tek tek tabaka olarak kültür yetişen ancak temas inhibisyonu gösterilecek. Bunun yerine, hücreler yoğun kültürlerde koloniler halinde büyürler. Düşük yoğunluklu, S2 kültürleri, yuvarlak ve gevşek bağlı cam veya doku kültürü ile tedavi edilen plastik yetişir. Ancak, S2 hücrelerinin sitoloji lektin, Concanavalin A (CONA) 3 ile kaplanmış bir yüzey üzerine kısaca kültür onlar tarafından yaygın bir biçimde düzleştirmek için onları teşvik ederek büyük ölçüde geliştirilmiş olabilir. S2 hücreleri de stabil bir şekilde etiket yapıları veya canlı ya da sabit hücrelerin ilgi organelleri floresan etiketli işaretleri ile transfekte olabilir. Bu nedenle, hücrelerin mikroskobik analizi için her zamanki senaryo şudur: Birincisi, S2 hücreleri (etiketli işaretleyicileri ifade transgenlerin sahip) bir hedef protein (ler) ortadan kaldırmak için RNAi tarafından tedavi edilir. RNAi tedavi süresi protein farklılıkların izin ayarlanabilir hedef protein canlılığı için önemli ise kinetiği ters çevirin ve hücre travma / ölümü en aza indirmek için. Daha sonra, tedavi edilen hücrelerin yaymak için hücreler neden ve sıkıca cama yapışır CONA önceden kaplı lamel içeren bir çanak aktarılır. Son olarak, hücreler araştırmacı mikroskopi modları seçimi ile görüntülü. S2 hücreler, bu hücrelerin, oda sıcaklığında ve normal atmosfer sağlıklı kalmak, canlı hücreleri, uzun görselleştirme gerektiren çalışmalar için özellikle iyi.
Protocol
Discussion
Hücre biyolojisi alan için ideal bir sistem, kolay manipüle korumak için ucuz olacağını ve çeşitli teknikler için uygun. Drosophila S2 hücreleri bu gereksinimleri karşılamak ve böylece hızla büyüyen bir hücre sayısı için tercih edilen sistem haline gelmiştir biyoloji laboratuvarları.
Biz yöntemleri mikroskopi için S2 hücreleri hazırlamak için kısa bir özetini sundu. Dikkate değer bir erdemdir S2 hücreler normal atmosfer ve oda sıcaklığında iyi bü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü P30 CA23074, Amerikan Kanser Derneği Kurumsal Araştırma Bursu 74-001-31 ve Üniv tarafından desteklendi. Arizona GI SPOR (NCI / NIH CA9506O).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| S2 cells | ATCC | CRL-1963 | http://www.atcc.org/ | |
| S2 cells | DGRC | stock number 6 | https://dgrc.cgb.indiana.edu/ | |
| S2 cells | Invitrogen | R690-07 | ||
| Sf900 II | Invitrogen | 10902-096 | serum-free medium | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Scientific | SH30278 | serum-free medium | |
| Insect-Xpress | BioWhittaker | 12-730 | serum-free medium | |
| Schneider’s S2 medium | Invitrogen | 11720-034 | Add 10% (final) heat-inactivated FBS to make complete medium. | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438026 | heat inactivated | |
| 100x antibiotic solution | MP Biomedicals | 91674049 | contains penicillin (10000 U/mL), streptomycin (10000 μg/mL), and amphotericin B (25 μg/mL) |
|
| Concanavalin A | MP Biomedicals | 195283 | ||
| Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | 32% solution | |
| Methanol | Mallinckrodt Baker | 9049 | anhydrous, ACS grade | |
| Molecular sieves | Acros Organics | 19724 | type 3A |
References
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).
- Goshima, G. Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Science. 316, 417-421 (2007).
