תסיסנית שניידר (S2) הם תאים מערכת פופולרי יותר ויותר על גילוי וניתוח פונקציונלי של גנים. המטרה שלנו היא לתאר כמה טכניקות להפוך תאים מיקרוסקופיים S2 כגון מערכת ניסיונית חשוב יותר ויותר.
Abstract
מערכת הניסוי האידיאלי יהיה זול וקל לתחזוקה, מקובל מגוון רחב של טכניקות, יהיה נתמך על ידי ספרות ענפה רצף הגנום באתר. בתרבית תאים תסיסנית S2, תוצר של 20-24 עוברים משויך 1 שעה הישן, בעל כל התכונות האלה. כתוצאה מכך, התאים S2 הם מאוד מתאימים לניתוח של תהליכים תאיים, כולל גילוי הגנים המקודדים את המרכיבים המולקולריים של תהליך או מנגנון של עניין. התכונות של תאים S2 שאחראים ביותר עבור השירות שלהם הקלות שבה הם נשמרים, רגישות מופלאה שלהם להפרעות פעמיים תקועים RNA בתיווך (DS) (RNAi), ו נהילות שלהם מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמו גם לחיות או קבוע תאים.
תאים S2 ניתן לגדל מגוון רחב של כלי התקשורת, כולל מספר זול, זמין מסחרית, מלא מוגדרים, סרום ללא התקשורת 2. בנוסף, הם גדלים בצורה אופטימלית ובמהירות על 21-24 מעלות צלזיוס, יכול להיות מתורבת במגוון רחב של מיכלים. שלא כמו בתאי יונקים, תאים S2 אינם דורשים אווירה מוסדר, אך במקום לעשות היטב עם אוויר רגיל יכול אפילו להיות נשמר צלוחיות אטום.
משלימים את הקלות של RNAi בתאים S2 היא היכולת לנתח בקלות פנוטיפים בניסוי המושרה על ידי שלב או מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים קבוע או לחיות. תאים S2 לגדול בתרבות כמו בשכבה יחידה, אבל לא להציג עיכוב קשר. במקום זאת, תאים נוטים לגדול במושבות בתרבויות צפופה. באותה צפיפות נמוכה, תרבויות S2 גדל על זכוכית או תרבות שטופלו פלסטיק רקמות עגולות רופף המצורפת. עם זאת, ציטולוגיה של תאים S2 ניתן לשפר במידה ניכרת בכך שפיתה אותם לשטח נרחב על ידי culturing בקצרה אותם על משטח מצופה לקטינים, concanavalin (ConA) 3. תאים S2 יכול להיות גם transfected ביציבות עם סמנים fluorescently-tagged למבנים תווית או אברונים עניין בתאים חיים או קבוע. לכן, התרחיש הרגיל עבור ניתוח מיקרוסקופי של תאים היא זו: הראשונה, תאים S2 (אשר יכול להחזיק transgenes להביע סמנים מתויג) מטופלים על ידי RNAi לחסל את חלבון המטרה (ים). זמן RNAi הטיפול יכול להיות מותאם כדי לאפשר הבדלים חלבון להתהפך קינטיקה כדי למזער טראומה תא / מוות אם חלבון המטרה חשובה הכדאיות. בשלב הבא, בתאים שטופלו מועברים מאכל המכיל coverslip מראש מצופה conA לגרום לתאים להתפשט בחוזקה לדבוק הזכוכית. לבסוף, התאים הם צילמו עם הבחירה של החוקר מצבי במיקרוסקופ. תאים S2 טובים במיוחד ללימודי הדורשים ראיה מורחבת של תאים חיים מאז תאים אלה להישאר בריאים בטמפרטורת החדר ואת האווירה נורמלי.
Protocol
1. הכנת התאים S2 עבור מיקרוסקופיה תאים שניידר S2 הופקו מעוברים מאוחר trypsinized אורגון R תסיסנית. התרבות המקורית של שניידר מורכב מתערובת של סוגי תאים, אך הפכה הומוגנית יותר עם חלוף המשיכו 1. הם תוארו כמי macrophage דמויי (הם phagocytic) …
Discussion
עבור שדה ביולוגיה של התא, מערכת האידיאלי יהיה זול לתחזוקה, קל לתפעל, ו מקובל מגוון רחב של טכניקות. תאים תסיסנית S2 לספק את הדרישות הללו, ולכן יש להפוך במהירות את המערכת של בחירה עבור מספר הולך וגדל של התא מעבדות הביולוגיה.
הצגנו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכון הלאומי לסרטן P30 CA23074, האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן מחקר מוסדיים גרנט 74-001-31, ואת Univ. אריזונה GI נבג (NCI / CA9506O NIH).
Buster, D. W., Nye, J., Klebba, J. E., Rogers, G. C. Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy. J. Vis. Exp. (40), e1982, doi:10.3791/1982 (2010).