Bu makale BioRad düzgün soğan epidermal hücrelerin içine plazmid DNA tanıtmak için Helios Gen Tabancası ve nasıl Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) ilkesine dayalı soğan hücreleri protein-protein etkileşimleri test etmek için nasıl kullanılacağını göstermektedir
Abstract
Çeşitli organizmaların gen fonksiyonu incelenmesi gen ürünleri, normal hücresel bir ortamda birbirleri ile nasıl etkileşimde bilgisine dayanmaktadır. Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) Testi<sup> 1</sup> Araştırmacılar, canlı hücreler protein-protein etkileşimleri görüntülemenizi sağlar ve önemli bir araştırma aracı haline gelmiştir. Bu testte, her bir potansiyel etkileşen protein ortak erimiş bir floresan protein (GFP) iki parça kolaylaştırdı ilişkisi üzerine dayanır. Iki protein ortakları etkileşim floresan yol açan, N-terminal ve C-terminal GFP parçası dernek kolaylaştıracaktır. Bitki araştırmacılar için, soğan epidermal hücreler, soğan dokuların elde edilmesi ve hazırlanmasında kolaylık ve minimum eşiğe floresan doğrudan görselleştirme BiFC tahlil yapılması için ideal bir deneysel sistem. Helios Gen Tabancası (BioRad) yaygın soğan hücreleri plazmid DNA bombardıman için kullanılır. Kullanımı iki etkileşim için plazmid yapıları tanıtmak Gen Tabancası Helios göstermektedir.<em> Arabidopsis thaliana</em> Transkripsiyon faktörleri, Seuss (SEU) ve Leunig homolog (LUH)<sup> 2</sup> Ve soğan epidermal hücreler BiFC aracılığı ile kendi etkileşimlerinin görselleştirme.
Protocol
I. Plazmid hazırlık Bombardıman için kullanılan plazmid DNA 500ng/μl veya daha büyük bir konsantrasyon ve yüksek saflıkta olmalıdır. BiFC iki plazmid yapıları içeren, her plazmid 25 mg gereklidir. Diğer bir deyişle, iki plazmid 1:1 molar oranda kartuşlarının hazırlanması için 50 mg toplam plazmid DNA doğuran karıştırılmalıdır. 50 mg daha fazla DNA ekleyerek altın parçacıkları yığılma neden olabilir ve kaçınılmalıdır dikkatli olun. Ticari olarak mevcut …
Discussion
GFP veya 35S:: GUS ilk kez kullanıcılar için, biz böyle 35S gibi tek bir plazmid kurucu muhabiri, kartuş hazırlanması gözlem, tüm prosedürü uygulamak öneririz. Biz 35S kullandı: plazmid GFP elde edilen Dr. Steve Mount ve Xiaoning Zhang 6 (Şekil 1A, D). RioRad (Kedi 165-2244) satılan gen atış kontrol kartuşları bitkiler için uygun değildir.
BiFC için, ikinci bir pozitif kontrol sırasıyla YFP C-terminal ve N-terminal parçalara kaynaşmış iki bilinen etkileşim ortakları, oluşmalıdır ger…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Dr teşekkür ederim. 35S Steve Mount ve Xiaoning Zhang: GFP pGlowbug inşa ve Z. L's laboratuvarda CH Araştırma Hokensen Doktora Bursu, ABD Ulusal Bilim Vakfı (IOB0616096 ve MCB0744752) tarafından desteklenmektedir. ZL, Maryland Zirai Araştırma İstasyonu Üniversitesi tarafından kısmen destekleniyor.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Yellow onion
Any supermarket
Helios Gene Gun
BioRad
Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP
Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun. J. Vis. Exp. (40), e1963, doi:10.3791/1963 (2010).