이 프로토콜은 세 설명<em> Drosophila</em> 준비 : 눈을 디스크 두뇌 단지의 절개를 개발 1) 성인 뇌 해부, 2) 성인 망막의 해부 3). 모든 준비가 고정 조직 immunohistochemistry 사용할 수 있지만 강조는 특별한 준비 기술과 라이브 영상을위한 조건 마련이다.
<em> Drosophila</em> 두뇌와 시각 시스템의 연결을 광범위하게 개발, 기능과 퇴보를 공부하기 위해 모델 시스템을 이용하고 있습니다. 여기는 세 두뇌의 준비와 개발 pupae의 개발 눈을 디스크 뇌의 복잡한에서 파리 성충에서 각각의 안구와 뇌 해부 범위를 커버 영상 시스템을 보여줍니다. 모든 프로토콜은 준비 라이브 문화 최적화되어 있습니다. 그러나, 우리는 고정 조직 immunohistochemistry 어디에 적용을위한 조건을 제시한다. 마지막으로, 우리는 재관류 챔버에서 종래와 공진 4D 공촛점 라이브 이미지를 사용하여 이러한 준비에 대한 라이브 이미징 조건을 보여줍니다. 함께,이 프로토콜은 몇 시간의 규모 발달이나 퇴행성 프로세스 분 규모의 기능성 세포 assays에 이르기까지 다양한 시간 스케일에서 라이브 영상에 대한 기초를 제공합니다.
이미징에 사용 형광 프로브
여기 세 가지 클래스에서 형광 프로브의 선택에 대한 Drosophila 영상 시스템 준비의 강점과 한계를 설명합니다 : exogenously 살아있는 조직을 준비에 추가됩니다 (1) 프로브, 유전자 살고 모두 인코딩됩니다 (2) 형광 단백질 고정 이미지, immunohistochemistry에 대한 고정 조직에 추가됩니다 (3) 형광 염료.
1. 외인성 프로브 :
Lysotracker 그린 DND – 26 또는 DND – 99 레드 (Invitrogen, 주식 회사) 이들은 형광 막 – 투과 가장 눈에 띄게 세포, lysosomes에 강력히 산성 구획에 축적 화합물, 후반 endosomes, 그리고 autophagosomes 상용 사용할 수 있습니다. nanomolar 농도 (우리가 일반적으로 50 nm의 사용)에서 Lysotracker 완전히 미만 분 L3와 P 20% 아이 디스크를 투과해 들어갔던 것이다. Lysotracker은 지속적으로 축적하고 5 분 미만의 alkalizing 효과, 우리는 이미지를 미치는 때문에. 눈에 디스크와는 달리, Lysotracker은 조직의 파괴없이 머리를 침투하지 않습니다. 그러나, 외부 멤브레인의 찢어주의는 광 엽 몇 세포 직경의 침투 수 있습니다.
Lysosensor DND – 189 Lysotracker 대조적으로 (Invitrogen 주식 회사)가 Lysosensor은 산성의 구획에 축적되지 않지만, 전시 산성 산도에 형광 증가했다. Lysosensor는 Lysotracker 매우 유사 침투 특성이 있습니다. 우리는 1μM의 농도에 Lysosensor을 사용합니다.
2. 유전자 인코딩 프로브 :
많은 라이브 이미징 실험을 위해, 우리는 GFP, TagRFP 10 바이너리 Gal4/UAS 표현 시스템 12 통제 산도에 민감한 pHluorin 11 같은 다양한 형광 분자로 태그 유전자를 표현한다. 개발 photoreceptors의 표현 Gal4 – 라인 GMR – Gal4 (모든 photoreceptors) 8 mDelta0.5 – Gal4 (R4와 R7을 개발) 13가 포함되어 있습니다. 몇몇 subtype 특정 Gal4 – 드라이버 라인 사용하는 다른 Rhodopsin의 발기인 14 존재합니다. 라이브 영상에 특히 유용합니다 형광 프로브는 photoconvertible 단백질입니다. 우리는 성공적으로 Dendra2, monomeric 녹색 – 투 – 붉은 photoconvertable 단백질 15를 사용했습니다. Dendra2가 488nm 아르곤 레이저 라인을 사용하여 photoconvertible 수 있도록 설계됩니다. 그러나, 우리는 기존의 또는 공진 중 공촛점 스캔 모드에서의 설정을 사용하여 보이는 푸른 불빛을 사용하여 변환을 달성할 수 없습니다. 반면, 405nm UV 레이저로 변환 효율적입니다.
3. Immunohistochemistry :
고정 성인 아이에 대한, 우리는 자주 rhabdomeric 구조 (그림 1A)를 시각화하는 rhodamine phalloidin (Invitrogen 주식 회사) 또는 방지 Chaoptin (photoreceptor 특정 항체 16) 중 하나를 선택합니다. 라미나 카트리지 구조를 분석하는 좋은 방법은 안티 – chaoptin 16, glial 마커 방지 흑단 17 및 안티 sec6 18 일 (그림의 1B)를 결합하는 것입니다. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 3 항체의 조합은 주요 presynaptic (chaoptin)와 postsynaptic (sec6) 프로세스뿐만 아니라 라미나 19 상피 glia (흑단)을 구별.
재관류 회의소 조립
라이브 영상을 위해, 우리는 조직 준비를 방해하지 않고 솔루션의 느린 교환을 허용하는 재관류 챔버를 사용합니다. 재관류 챔버 어셈블리의 행동은 동영상에 포함되어 있으며 간략하게 구조 그림 2에 표시됩니다. 재관류 챔버의 어셈블리 그림 그림입니다. 2A. 먼저 표본을 통해 근육을 마련함으로써 시작하고, 다음 그림과 같이 조립을 계속합니다. 가스켓의 목적은 챔버의 기본과 뚜껑, 조직 밀봉하고이를 통해 솔루션이 흐름되는 내부 공간 사이에 공간을 만드는 것입니다. 개스킷 내부 공간은 입구 (솔루션이 여기 입력), 조직 준비하고, 솔루션은 챔버 나뭇잎하는 통해 콘센트를 포함해야합니다. 가스켓의 두 기능은 중요합니다 : 첫째, 가스켓 아직 고해상도 렌즈 영상을 허용하도록 충분히 얇은 두뇌 정도 두께가되어야합니다. 이상적인 가스켓 두께가 설정 특정 매개 변수에 따라 달라집니다. 둘째, 근육에있는 노치가 거품이 시편 (그림 2B)를 문의하지 않고 통과하도록 허용하는 구획을 제공합니다.
현미경에서 이미징
우리는 직접 슬라이드에있는 문화 매체에 재관류 챔버 또는 63x 물 침지 렌즈를위한 63x (조리개 1.3) 글리세린 침지 렌즈를 사용합니다. 글리세린 렌즈는 석유 렌즈보다 작동 거리를 제공합니다. 우리는 종래의 스캐너 (8,000 Hz에서 1,400 Hz에서 비교, 각각)보다 훨씬 빠른 속도로 스캔 공진 스캔 공촛점 현미경을 사용합니다. 공진 스캔 빠르게에서 시간이 지남에 3 차원 녹음이 가능합니다어 프레임 속도. 또한, 빠른 스캔 속도는 상당히 살아있는 조직의 반복 검사에 대한 주요 관심사입니다 레이저 phototoxicity 6 줄일 수 있습니다. 레이저 강도와 PMT 전압 (이득)의 균형은 노이즈를 최소화하고 photobleaching하면서 신호를 최대화하기 위해 달성해야합니다. 중요한 추가 고려 사항 주어진 지역에 레이저에 미치는 영향의 크기는 해상도와 줌에 의해 결정됩니다 것입니다. 예를 들어, 선택의 지역은 512×512, 확대 1X에서와 같은 256×256, 확대 2X에서 동일한 해상도로 스캔, 아직 maximally 가능한 라이브 영상 속도는 256×256에서 줌 2 배 4 배 빠릅니다. 신속 세포내 구획을 이동의 활동을 기록하기 위해, 우리는 성공적으로 다음과 같은 설정으로 기록했습니다 : Z – 스택 당 5 프레임 하나의 속도로 8,000 Hz에서와 2X 라인 평균의 스캔 속도로 10초 당 Z – 스택. 시간의 규모에 긴 이미징 세션에, 우리는 종종 몇 분 당 한 프레임 속도를 줄이고 준비가 전환 될 가능성이 더욱 높아집니다로 큰 영역을 선택합니다.
Drosophila 비주얼 시스템 해부학
그림 3은 Drosophila의 성인 아이 (그림 3A), 성인 뇌 (그림 3B), 그리고 20 % -25 % pupal 눈 디스크 / 두뇌 복합 (그림 3C)의 해부를 보여줍니다. 그림 3A 함께하고 얇은 판과 연결된 지방세포없이 모두 성인 눈을 보여줍니다. 성인 눈 해부 동안 photoreceptor 세포 기관 (왼쪽)에 의해 형성된 그릇에 자리잡고 눈의 중앙에있는 얇은 판은, (오른쪽) 아래 세포의 시체를 중단하지 않고 제거해야합니다. 성인 뇌 해부 들어, 하나는 photoreceptor 세포 기관, 얇은 판, 광 엽, 중앙 두뇌 및 기관 (그림 3B)를 구별할 수 있어야합니다. 광학 엽에 부착된 얇은 판을 떠나는 동안 photoreceptors과 기관이 해부를 위해 삭제해야합니다. 20-25% pupal 눈 디스크 / 두뇌 단지의 식별에 투입, 실제 이미지가 그림 3C에 표시됩니다.
그림 1. (A) 성인 뇌. (B) 성인 아이. (C) 20 % -25 % pupal eye-disc/brain 복합 있습니다.
그림 2. (A) 재관류 챔버 어셈블리 및 표본에 비해 (B) 개스킷 위치.
그림 3. 방지 chaoptin를 사용하여 (A) 성인 rhabdomere 염색법. 안티 chaoptin (녹색, photoreceptors), 안티 – 백 (빨강, glia), 그리고 sec6 (파란색, interneurons)를 사용하여 (B) 성인 라미나의 얼룩.
이 작품은 웰치 재단 (I – 1657)와 NIH (RO1EY18884)에서 보조금에 의해 지원되었다. PRH는 바이오 메디컬 연구에 유진 맥더멋 학자이다.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Sylgard 184 | Dow Corning | 103251252 | ||
GluShield | GluStitch, Inc. | GB055QO | ||
20-Hydroxyecdysone | Sigma | H5142-10mg | 5mg/ml in EtOH |
Special Equipment: