Ce protocole décrit trois<em> Drosophile</em> Les préparations: 1) la dissection du cerveau adulte, 2) la dissection rétine adulte et 3) développer l'œil-cerveau disque de dissection complexes. L'accent est mis sur les techniques de préparation et des conditions particulières pour l'imagerie en direct, bien que toutes les préparations peuvent être utilisées pour l'immunohistochimie tissus fixés.
L'<em> Drosophile</em> Du cerveau et du système visuel sont largement utilisés pour étudier des systèmes modèles neuronaux développement, la fonction et la dégénérescence. Ici, nous montrons trois préparations du cerveau et du système visuel qui couvrent la gamme de l'œil de disque complexe du cerveau en développement dans les chrysalides en développement à l'œil et la dissection du cerveau individuels de mouches adultes. Tous les protocoles sont optimisés pour la culture vivante de la préparation. Cependant, nous présentons également les conditions pour l'immunohistochimie tissus fixés, le cas échéant. Enfin, nous montrons les conditions d'imagerie vivre pour ces préparations à l'aide conventionnelle et résonnante 4D imagerie confocale vivre dans une chambre de perfusion. Ensemble, ces protocoles fournissent une base pour l'imagerie en direct sur différentes échelles de temps allant de fonctionnelles dosages intracellulaires à l'échelle de minutes pour les processus de développement ou dégénératives sur l'échelle de plusieurs heures.
Sondes fluorescentes utilisés pour l'imagerie
Nous décrivons ici les forces et les limites de la préparation drosophile système visuel pour une sélection de sondes fluorescentes de trois classes: (1) Les sondes qui sont ajoutés à une préparation des tissus vivants de manière exogène, (2) les protéines fluorescentes qui sont génétiquement codés pour les deux vivent et imagerie fixe; (3) des colorants fluorescents qui sont ajoutés aux tissus fixés pour l'immunohistochimie.
1. Sondes exogènes:
Lysotracker vert MDN-26 ou Red MDN-99 (Invitrogen, Inc) Ce sont disponibles dans le commerce fluorescentes membrane perméable à des composés qui s'accumulent dans les compartiments fortement acidifié dans la cellule, le plus en évidence les lysosomes, endosomes tardifs, et autophagosomes. Lysotracker à des concentrations nanomolaires (nous utilisons généralement 50 nm) pénètre le disque L3 et P oeil 20% totalement en moins d'une minute. Depuis Lysotracker s'accumule en permanence et exerce un effet alcalinisant, nous avons l'image en moins de 5 minutes. Contrairement aux disques oeil, Lysotracker ne pénètrent dans le cerveau sans perturbation du tissu. Cependant, attention déchirure de la membrane externe permet la pénétration d'un diamètre de quelques cellules dans le lobe optique.
Lysosensor MDN-189 (Invitrogen, Inc) Contrairement à Lysotracker, Lysosensor ne s'accumule pas dans les compartiments acidifié, mais présente augmentation de fluorescence à pH acide. Lysosensor a des caractéristiques de pénétration qui sont très semblables à Lysotracker. Nous utilisons Lysosensor à une concentration de 1 uM.
2. Sondes génétiquement codés:
Pour de nombreuses expériences d'imagerie vivons, nous expriment les gènes marqués avec différentes molécules fluorescentes comme la GFP, TagRFP 10 ou le pHluorin sensibles au pH 11 sous le contrôle du système Gal4/UAS expression binaire 12. Gal4-lignes qui expriment dans les photorécepteurs de développement comprennent GMR-Gal4 (tous les photorécepteurs) 8 et mDelta0.5-Gal4 (développement R4 et R7) 13. Plusieurs sous-types spécifiques Gal4-pilote lignes existent qui utilisent différents promoteurs Rhodopsin 14. Particulièrement utile sondes fluorescentes dans l'imagerie en direct sont des protéines photoconvertible. Nous avons utilisé avec succès Dendra2, un monomère verte à rouge protéines photoconvertable 15. Notez que Dendra2 est conçu pour être photoconvertible utilisant un laser Argon 488nm ligne. Cependant, nous sommes incapables de réaliser la conversion en utilisant une lumière bleue visible à l'aide de notre set-up en mode de numérisation conventionnelles ou de résonance confocale. En revanche, la conversion avec le laser UV 405nm est efficace.
3. Immunohistochimie:
Pour l'œil adulte fixe, nous avons souvent le choix entre la rhodamine phalloïdine (Invitrogen, Inc) ou anti-Chaoptin (un anticorps spécifique des photorécepteurs 16) pour visualiser la structure rhabdomeric (figure 1A). Une bonne façon d'analyser la structure cartouche limbe est de combiner anti-chaoptin 16, le marqueur glial anti-ébène 17, et anti-sec6 18 (Fig 1B). Comme le montre la Fig. 3, cette combinaison d'anticorps qui distingue les grands présynaptique (chaoptin) et post-synaptiques (sec6) des processus ainsi que la GLIA épithéliales (ébène) dans la lamina 19.
Assemblage de la chambre de perfusion
Pour l'imagerie en direct, nous employons une chambre de perfusion qui permet l'échange lente de solutions sans déranger la préparation des tissus. Une démonstration de l'assemblage chambre de perfusion est inclus dans la vidéo et schématisé à la figure 2. Assemblée de la chambre de perfusion est illustré dans la Fig. 2A. Commencez par la pose du joint sur le premier échantillon, et ensuite poursuivre l'assemblage, comme indiqué. Le but de la garniture est de créer un espace entre la base de la chambre et le couvercle, un espace à l'intérieur duquel le tissu est scellé et à travers lequel la solution de flux. L'espace à l'intérieur du joint doit inclure l'entrée (solution pénètre ici), la préparation des tissus, et la sortie à travers laquelle la solution quitte la chambre. Deux caractéristiques de la garniture sont essentiels: d'abord, le joint doit être suffisamment épaisse pour que le cerveau encore assez mince pour permettre l'imagerie avec une lentille à haute résolution. L'épaisseur du joint idéal dépend de configuration des paramètres spécifiques. Deuxièmement, une encoche dans le joint fournit un compartiment qui permet une bulle de passer à travers sans contact avec l'échantillon (figure 2B).
Imagerie au microscope
Nous utilisons un 63x (ouverture 1,3) lentille à immersion de glycérine pour la chambre de perfusion ou d'une lentille d'eau par immersion 63x directement dans le milieu de culture sur une diapositive. Glycérine lentilles fournir plus de travail à distance que les lentilles de pétrole. Nous utilisons un microscope à balayage confocal à résonance qui scanne à des taux beaucoup plus rapide qu'un scanner conventionnel (8000 Hz 1400 Hz par rapport, respectivement). Resonant permet la numérisation en 3 dimensions des enregistrements au fil du temps au fastdes taux de trame ER. En outre, les vitesses de numérisation plus rapide de réduire considérablement la phototoxicité laser 6 qui est une préoccupation majeure pour les scans répétés de tissus vivants. Un équilibre entre l'intensité du laser et la tension PMT (gain) doit être réalisé afin de maximiser le signal, tout en minimisant le bruit et photoblanchiment. Une considération importante est que la quantité d'impact laser sur une région donnée est déterminée par la résolution et le zoom. Par exemple, une région de choix est scanné à la même résolution à 256×256, un zoom 2x au 512×512, un zoom 1x, mais la vitesse maximale possible d'imagerie en direct est 4 fois plus rapide à 256×256, un zoom 2x. Pour enregistrer l'activité de déplacer rapidement des compartiments intracellulaires, nous avons réussi a enregistré avec les paramètres suivants: 5 images par Z-stack au rythme d'un Z-stack par 10 secondes avec une vitesse de balayage de 8000 Hz et moyenne gamme 2x. Pour les sessions d'imagerie longue à l'échelle de l'heure, nous avons souvent de réduire le taux de trame à un pour plusieurs minutes et choisissez grands domaines comme la préparation est plus susceptible de changement.
Anatomie drosophile Visual System
La figure 3 montre l'anatomie de l'œil adulte drosophile (figure 3A), le cerveau adulte (figure 3B), et les 20% -25% des yeux nymphe disque / complexe du cerveau (figure 3C). La figure 3A illustre l'œil adulte à la fois avec et sans la lame et les cellules graisseuses en annexe. Lors de la dissection des yeux des adultes, le limbe, qui est au centre de l'oeil niché dans une cuvette formée par les corps cellulaires des photorécepteurs (à gauche), doit être retiré sans perturber les corps cellulaires en dessous (à droite). Pour la dissection du cerveau adulte, on doit être capable de distinguer les corps cellulaires des photorécepteurs, la lame, le lobe optique, le cerveau central, et de la trachée (figure 3B). Les photorécepteurs et de la trachée ont besoin d'être retiré pour cette dissection, tout en laissant la lame attachée au lobe optique. Pour aider à l'identification de l'œil à 20-25% du disque / cerveau nymphe complexe, une image en direct est présenté dans la figure 3C.
Figure 1. Cerveau adulte (A). Œil adulte (B). (C) 20% -25% nymphe eye-disc/brain complexes.
Figure 2. (A) Assemblée chambre de perfusion et (B) joint positionnement par rapport à l'échantillon.
La figure 3 (A). Coloration adultes rhabdomere utilisant des anticorps anti-chaoptin. (B) coloration lamina adultes utilisant des anticorps anti-chaoptin (vert, les photorécepteurs), anti-ébène (rouge, cellules gliales), et sec6 (bleu, interneurones).
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Welch (I-1657) et le NIH (RO1EY18884). PRH est un chercheur Eugene McDermott dans la recherche biomédicale.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Sylgard 184 | Dow Corning | 103251252 | ||
GluShield | GluStitch, Inc. | GB055QO | ||
20-Hydroxyecdysone | Sigma | H5142-10mg | 5mg/ml in EtOH |
Special Equipment: