Summary

La medición del complemento hemolítico 50% (CH 50) La actividad de suero

Published: March 29, 2010
doi:

Summary

La vía clásica es activada por anticuerpos y que culmina en la lisis de las células diana. El CH<sub> 50</subEnsayo> proporciona una medida de la actividad del complemento de una muestra de suero. Este video muestra los pasos a seguir para determinar el CH<sub> 50</sub> De una muestra de suero, el cálculo y la interpretación de los resultados.

Abstract

El sistema del complemento es un grupo de proteínas que cuando se activa conducir a la lisis celular de destino y facilita la fagocitosis por opsonización. Los componentes individuales del complemento pueden ser cuantificados sin embargo, esto no proporciona ninguna información en cuanto a la actividad de la vía. El CH<sub> 50</sub> Es un ensayo de cribado para la activación de la vía clásica del complemento (Fig. 1) y es sensible a la reducción, la ausencia y / o inactividad de cualquiera de los componentes de la vía. El CH<sub> 50</sub> Pruebas de la capacidad funcional de los componentes del complemento del suero de la vía clásica de lisar glóbulos rojos de oveja (SRBC) pre-recubiertos con conejo anti-oveja de anticuerpos de glóbulos rojos (hemolisina). Cuando recubiertas de anticuerpos SRBC se incuban con suero, la vía clásica del complemento se activa y los resultados de hemólisis. Si un componente del complemento está ausente, el CH<sub> 50</sub> El nivel va a ser cero, si uno o más componentes de la vía clásica se reducen, el CH<sub> 50</sub> Se reducirá. Un volumen fijo de SRBC sensibilizados de forma óptima se añade a cada dilución de suero. Después de la incubación, se centrifuga la mezcla y el grado de hemólisis se cuantifica mediante la medición de la absorción de la hemoglobina liberada en el sobrenadante a 540 nm. La cantidad de la actividad del complemento se determina al examinar la capacidad de las diferentes diluciones del suero para lisar SRBC recubiertas de anticuerpos. Este video muestra los pasos experimentales que participan en el análisis del nivel de actividad del complemento de la vía clásica del complemento.

Protocol

Preparación de 5x buffer salino veronal (VBS) Para preparar la solución salina tamponada con veronal (VBS), tres soluciones distintas que estar preparados. Prepare una solución de 1 por disolución de NaCl y 21.25gm 0.94gm de barbital sódico en 350 ml de agua destilada. La concentración final de NaCl y de sodio son barbitona 1.02m y 13 mm respectivamente. Prepare una solución de 2 por disolución de 1.44gm barbitona en 125 ml de agua destilada caliente. La concentración final de bar…

Discussion

El CH 50 ensayo está sujeto a muchas interferencias. Algunos SRBC son más frágiles que otros, resultando en hemólisis espontánea que no está relacionada con la actividad del complemento. La afinidad de los anticuerpos de conejo varía de un lote a otro y de un fabricante a otro, lo que afecta a la cantidad de anticuerpo que se une a los SRBC. Además, el proceso de sensibilización de SRBC con resultados de anticuerpos en las células con diferentes cantidades de anticuerpos del recubrimiento SRBC. Reco…

Acknowledgements

El autor desea agradecer a la Srta. Lora Matthews para la realización de la técnica y el Sr. Pablo Pastor de la cinematografía. Este proyecto fue financiado por la Universidad de Australia del Sur, el programa de Medicina de Laboratorio.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Sheep red blood cells   CSL 2490201 Use at 1% final
Serum       Human serum
Rabbit Anti-Sheep Haemolytic serum (RBCs), Unconjugated   AdB Serotec C12HSB  
96 well flat bottom plate   Sarstedt 83.1839  
Veronal buffered saline       Use at 1x final
Waterbath        
Plate reader        
37°C room/incubator        

References

  1. Goldsby, R. A., Kindt, T. J., Osborne, B. A., Kuby, J. . Immunology. , (2003).

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Cite This Article
Costabile, M. Measuring the 50% Haemolytic Complement (CH50) Activity of Serum. J. Vis. Exp. (37), e1923, doi:10.3791/1923 (2010).

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