Este vídeo demonstra um método para dissecar e cultura de neurônios comissurais E13 rato medula espinhal dorsal. Dissociada neurônios comissurais são úteis para estudar os mecanismos celulares e moleculares do crescimento do axônio e orientação.
Neurônios comissurais têm sido amplamente utilizados para investigar os mecanismos subjacentes a orientação dos axônios durante o desenvolvimento embrionário medula espinhal. Os corpos celulares desses neurônios estão localizados na medula espinhal dorsal e seus axônios seguem trajetórias estereotipados durante o desenvolvimento embrionário. Axônios comissurais inicialmente para o projeto ventralmente floorplate. Depois de cruzar a linha média, esses axônios vez anteriormente e projeto para o cérebro. Cada uma dessas etapas é regulado pela ação de várias pistas de orientação. Culturas altamente enriquecido em neurônios comissurais são ideais para muitas experiências abordando os mecanismos de pathfinding axônio, incluindo ensaios de torneamento, imunoquímica e bioquímica. Aqui, nós descrevemos um método para dissecar e cultura de neurônios comissurais E13 rato medula espinhal dorsal. Em primeiro lugar, a medula espinhal é isolado e tiras dorsal são dissecados. O tecido é então dissociado dorsal em uma suspensão de células por tripsinização e perturbação mecânica. Neurônios são banhados em lamínulas poli-L-lisina-revestido de vidro ou de cultura de tecidos de pratos. Após 30 horas<em> In vitro</em>, A maioria dos neurônios ter estendido um axônio. A pureza da cultura (Yam<em> Et al.</em> 2009), geralmente mais de 90%, pode ser avaliada por imunomarcação com o comissural DCC marcadores neurônio, LH2 e tag1 (Helms e Johnson, 1998). Esta preparação neuronal é uma ferramenta útil para<em> In vitro</em> Estudos dos mecanismos celulares e moleculares do crescimento do axônio comissural e orientação durante o desenvolvimento da medula espinhal.
Nós descrevemos um método para dissecar e cultura neurônios comissurais do cordão espinhal de ratos embrionárias. Este procedimento tem sido utilizado rotineiramente em nosso laboratório para preparar os neurônios de forma confiável para estudar os mecanismos celulares e moleculares de orientação axônio. Para a biologia celular e experimentos imunoquímica, a dissecção de uma ninhada produz neurônios suficientes. Quando as células são mais necessários, como em muitos experimentos de bioquímica, dissec?…
Este trabalho foi financiado por concessões do Canadian Institutes of Health Research (CIHR), o Peter Lougheed Medical Research Foundation, o Programa de McGill em Neuroengenharia, o Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ), ea Fundação Canadense para Inovação (CFI ). Sébastien D. Langlois foi apoiada pelo Prêmio de Mestre de Formação do Fonds de la Recherche en santé du Québec (FRSQ) e Frederick Banting por Charles e Prêmio de Melhor Canadá de Pós-Graduação Mestrado Bolsas de Estudo a partir do Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Somos gratos a Jessica MT Pham de assistência com os números.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Neurobasal medium, liquid | Invitrogen | 21103-049 | See Recipes and Comments | |
B27 supplement 50X | Invitrogen | 17504 | See Recipes and Comments | |
Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma | P4707 | ||
L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-070 | ||
Trypsin 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090-046 | ||
DNAse I, 25000 U/mL | Worthington | |||
MgSO4 | Sigma | M2643 | ||
HBSS, Ca2+/Mg2+-free | Invitrogen | 14170-112 | ||
L-glutamine 200mM, liquid | Invitrogen | 25030-081 | See Recipes and Comments |
Dissection of embryonic rat dorsal spinal cord (see also Table I)
Commissural neuron culture (see also Table I)