Fluorescencia de células activadas por la clasificación de los protoplastos de la planta
Summary
Un método para el aislamiento de determinados tipos de células a partir de material vegetal se demuestra. Esta técnica emplea las líneas transgénicas que expresan proteínas fluorescentes marcador en los tipos de célula en particular, la disociación y la fluorescencia celular selección de células activadas. Además, un crecimiento de configuración se ha establecido aquí que facilita el tratamiento de<em> Arabidopsis thaliana</em> Plantones antes de la clasificación de células.
Abstract
De alta resolución, el tipo específico de célula de análisis de la expresión génica mejora considerablemente la comprensión de la regulación del desarrollo y las respuestas a los estímulos del medio ambiente en cualquier organismo multicelular. Hibridación in situ y la visualización del gen reportero puede hasta cierto punto se utiliza para este fin, sino para alta resolución cuantitativa RT-PCR o de alto rendimiento en todo el análisis del transcriptoma el aislamiento de ARN a partir de tipos de células es un requisito. Disociación celular de los tejidos que expresan un marcador de la proteína fluorescente en un tipo específico de célula y la posterior clasificación de células activadas fluorescencia (FACS) hace que sea posible reunir una cantidad suficiente de material para la extracción de ARN, el análisis de cDNA síntesis / amplificación y microarrays.
Un amplio conjunto de tipo de células específicas líneas reportero fluorescente está disponible para la comunidad de investigación de la planta. En este caso, dos líneas de marcador de la raíz de Arabidopsis thaliana se utilizan: P SCR:: GFP (endodermis y el centro de reposo) y P WOX5:: GFP (centro de reposo). Un gran número (miles) de las plántulas se cultivan hidropónicos o en placas de agar y se cosechan para obtener material suficiente raíz para su posterior análisis. Disociación celular de material vegetal se obtiene por digestión enzimática de la pared celular. Este procedimiento hace uso de alta osmolaridad inducida plasmólisis y celulasas disponibles en el mercado, pectinasas y hemicelulasas para liberar protoplastos en la solución.
FACS de las buenas prácticas agrarias de células positivas hace uso de la visualización de los verdes contra los espectros de emisión de color rojo de protoplastos excitado por un láser de 488 nm. GFP-positivas protoplastos se pueden distinguir por su relación cada vez mayor de verde a la emisión de color rojo. Protoplastos son típicamente ordenados directamente en tampón de extracción de ARN y se almacena para su posterior procesamiento en un momento posterior.
Esta técnica se revela que es sencillo y práctico. Además, se demuestra que se puede utilizar sin dificultad de aislar un número suficiente de células para el análisis de transcriptoma, incluso para los tipos de células muy escasos (por ejemplo, las células del centro de reposo). Por último, una configuración de crecimiento de plántulas de Arabidopsis se ha demostrado que permite el tratamiento sin complicaciones de las plantas antes de la clasificación de células (por ejemplo, para el tipo específico de célula de análisis de las respuestas al estrés biótico o abiótico). Complementarios usos potenciales de FACS de protoplastos de plantas se discuten.
Protocol
Discussion
Protoplastos puede, en principio, se derivan de una variedad de tejidos de la planta, optimización de las condiciones favorables en gran medida mejorar la calidad y la cantidad de ARN. Tanto la solución protoplasting y el tampón de incubación electiva utilizado influirá en este aspecto.
Muchas proteínas fluorescentes se pueden utilizar diferentes, dependiendo de las capacidades de la FACS utiliza, por ejemplo, GFP, RFP, YFP, PPC o sus muchas variantes y derivados. La expresió…
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la National Science Foundation (subvención no. DBI 0519984) y los Institutos Nacionales de Salud (concesión no. 5R01GM078279) ..
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 250 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-250/50 | ||
| 100 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-100/47 | ||
| Square petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-10k | ||
| Phytatrays | Sigma | P1552 | ||
| Murashige and Skoog Basal Medium (MS) | Sigma | M5519 | ||
| sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | ||
| MES | Sigma | M2933 | ||
| KOH | Sigma | P1767 | 10 M stock | |
| Eclipse 90i microscope | Nikon | |||
| Cellulase R-10 | Yakult Pharmaceutical | |||
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical | |||
| D-mannitol | Sigma | M9546 | ||
| KCl | Sigma | P8041 | 1 M stock | |
| BSA | Sigma | A3912 | ||
| β-mercaptoethanol | CALBIOCHEM | 444203 | ||
| CaCl2 | Sigma | C2536 | 1 M stock | |
| orbital shaker | LAB-LINE | |||
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | ||
| conical 15 ml tubes | BD Falcon | 352196 | ||
| table centrifuge | Sorvall | Legend RT | ||
| NaCl | Sigma | S3014 | ||
| FACSAria | BD | |||
| 1.5 ml microfuge tubes | VWR | 20170-38 | ||
| RNeasy micro kit | QIAGEN | 74004 | ||
| WT-Ovation Pico RNA Amplification System | NuGEN | 3300_12 | ||
| FL-Ovation cDNA Biotin Module V2 | NuGEN | 4200_12 |
References
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