Fluorescence Activated Cell Sorting von Pflanzenprotoplasten
Summary
Ein Verfahren zur Isolierung von spezifischen Zelltypen aus pflanzlichem Material nachgewiesen ist. Diese Technik bedient sich transgene Marker exprimieren fluoreszierenden Proteinen in bestimmten Zelltypen, Zell-Dissoziation und Fluorescence Activated Cell Sorting. Zusätzlich wird ein Wachstum Setup hier erleichtert Behandlung von etablierten<em> Arabidopsis thaliana</em> Setzlinge vor cell sorting.
Abstract
Hochauflösende, Zelltyp-spezifische Analyse der Genexpression stark erhöht das Verständnis von Entwicklungs-Regelung und Antworten auf Reize aus der Umwelt in allen vielzelligen Organismus. In-situ-Hybridisierung und Reporter-Gen-Visualisierung kann in begrenztem Umfang zu diesem Zweck verwendet werden, aber für hochauflösende quantitative RT-PCR oder High-Throughput-Transkriptom-weite Analyse der Isolierung von RNA aus bestimmten Zelltypen ist Voraussetzung. Cellular Dissoziation von Gewebe exprimiert ein fluoreszierendes Protein-Marker in einem bestimmten Zelltyp und anschließende Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) macht es möglich, ausreichende Mengen an Material für die RNA-Extraktion, cDNA-Synthese /-Amplifikation und Microarray-Analyse zu sammeln.
Ein umfangreiches Set von Zelltyp-spezifischen fluoreszierenden Reporter-Linien ist für die Pflanze verfügbar Forschungsgemeinschaft. In diesem Fall sind zwei Markierungslinien der Arabidopsis thaliana Wurzel verwendet: P SCR:: GFP (Endodermis und ruhenden Mitte) und P WOX5:: GFP (Ruhe-Center). Große Zahlen (in Tausend) der Sämlinge sind hydroponically oder auf Agarplatten gewachsen und geerntet, um genügend root Material für weitere Analysen zu erhalten. Cellular Dissoziation von Pflanzenmaterial wird durch enzymatische Verdauung der Zellwand erreicht. Dieses Verfahren nutzt hohe Osmolarität induzierte Plasmolyse und kommerziell erhältliche Cellulasen, um Pektinasen und Hemicellulasen Protoplasten in Lösung freigeben.
FACS von GFP-positiven Zellen nutzt die Visualisierung der grünen gegen die roten Emissionsspektren von Protoplasten von einem 488 nm Laser angeregt. GFP-positive Protoplasten können durch ihre erhöhte Verhältnis von Grün auf Rot-Emission unterschieden werden. Protoplasten werden in der Regel direkt in RNA-Extraktionspuffer sortiert und für die weitere Verarbeitung zu einem späteren Zeitpunkt.
Diese Technik wird enthüllt werden einfach und praktikabel ist. Darüber hinaus wird gezeigt, dass sie ohne Schwierigkeiten eine ausreichende Anzahl von Zellen für die Transkriptom-Analyse zu isolieren können verwendet werden, auch bei sehr knappen Zelltypen (zB Ruhe-Zentrum-Zellen). Schließlich ist ein Wachstumsmarkt Setup für Arabidopsis-Keimlinge zeigten, dass ermöglicht eine unkomplizierte Behandlung der Pflanzen vor Zellsortierung (zB für die Zelltyp-spezifische Analyse der biotischen und abiotischen Stress-Reaktionen). Mögliche zusätzliche Einsatzmöglichkeiten für FACS von pflanzlichen Protoplasten werden diskutiert.
Protocol
Discussion
Protoplasten können im Prinzip aus einer Vielzahl von pflanzlichen Geweben abgeleitet werden, die Optimierung der günstigen Bedingungen ermöglicht eine wesentlich bessere RNA Qualität und Quantität. Sowohl die Protoplastierung Lösung und die Wahl Inkubationspuffer beeinflussen diesen Aspekt.
Viele verschiedene fluoreszierende Proteine verwendet werden können, je nach den Fähigkeiten der FACS verwendet werden, zB GFP, RFP, YFP, CFP oder ihren vielen Varianten und Deriva…
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (Grant No. DBI 0519984) und die National Institutes of Health (Grant No. 5R01GM078279) unterstützt ..
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 250 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-250/50 | ||
| 100 μm nylon mesh | Sefar Filtration | NITEX 03-100/47 | ||
| Square petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-10k | ||
| Phytatrays | Sigma | P1552 | ||
| Murashige and Skoog Basal Medium (MS) | Sigma | M5519 | ||
| sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | ||
| MES | Sigma | M2933 | ||
| KOH | Sigma | P1767 | 10 M stock | |
| Eclipse 90i microscope | Nikon | |||
| Cellulase R-10 | Yakult Pharmaceutical | |||
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical | |||
| D-mannitol | Sigma | M9546 | ||
| KCl | Sigma | P8041 | 1 M stock | |
| BSA | Sigma | A3912 | ||
| β-mercaptoethanol | CALBIOCHEM | 444203 | ||
| CaCl2 | Sigma | C2536 | 1 M stock | |
| orbital shaker | LAB-LINE | |||
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | ||
| conical 15 ml tubes | BD Falcon | 352196 | ||
| table centrifuge | Sorvall | Legend RT | ||
| NaCl | Sigma | S3014 | ||
| FACSAria | BD | |||
| 1.5 ml microfuge tubes | VWR | 20170-38 | ||
| RNeasy micro kit | QIAGEN | 74004 | ||
| WT-Ovation Pico RNA Amplification System | NuGEN | 3300_12 | ||
| FL-Ovation cDNA Biotin Module V2 | NuGEN | 4200_12 |
References
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