Dissezione di vivere Drosophila Embrioni: Metodi semplificati per lo screening Collezioni Mutant dalla colorazione anticorpale
Summary
Noi descriviamo un protocollo semplificato per la generazione di "filetto" preparati di embrioni di Drosophila genotipi specifici. Questo protocollo permette l'esecuzione efficiente di una varietà di schermi genetica. Inoltre permette una visualizzazione eccellente delle strutture nell'embrione tardi.
Abstract
Embrioni di Drosophila tra 14 e 17 stadi dello sviluppo embrionale può essere facilmente sezionato per generare "filetto" preparati. In questi preparativi, il sistema nervoso centrale funziona a metà, ed è affiancato dalle pareti del corpo. Molti fenotipi differenti sono stati esaminati utilizzando tali preparati. Nella maggior parte dei casi, i filetti sono stati generati da dissezione di anticorpi colorati fisso intero montaggio embrioni. Questi "dissezioni fisso" sono alcuni svantaggi, però. Si tratta di tempo per eseguire, ed è difficile per ordinare mutante (GFP-negativo) gli embrioni provenienti da stock nel quale sono mantenute le mutazioni più cromosomi bilanciatori GFP. Dal 2002, il nostro gruppo sta conducendo carenza e schermi espressione ectopica di identificare ligandi per i recettori orfani. Per fare questo, abbiamo sviluppato protocolli ottimizzato per la dissezione dell'embrione dal vivo e colorazione degli anticorpi di raccolte contenenti centinaia di linee bilanciate. Abbiamo concluso che è molto più efficiente per esaminare fenotipi in grandi collezioni di scorte da dissezione dal vivo che da dissezione fisso. Utilizzando il protocollo qui descritto, un singolo individuo addestrato può schermo fino a 10 righe al giorno per fenotipi, esaminando 4-7 embrioni mutanti da ogni riga sotto un microscopio composto. Ciò permette l'identificazione di mutazioni conferimento sottile, a bassa penetranza fenotipi, dato che fino a 70 hemisegments per linea sono segnati a forte ingrandimento 40X con un acqua-immersion lente.
Protocol
Discussion
Ci auguriamo che questa dimostrazione video ha mostrato i nostri metodi per la dissezione dell'embrione dal vivo e colorazione in modo sufficientemente dettagliato che adesso possono essere facilmente eseguito da una persona che ha una certa esperienza in Drosophila genetica e dell'embriologia. Naturalmente, la pratica considerevole sarà ancora necessaria, soprattutto per gli stessi dissezioni. Nella nostra esperienza, ogni persona che impara i metodi di dissezione dal vivo crea un protocollo di dissez…
Acknowledgements
Ringraziamo Nicki Fox e Aloisia Schmid per il loro contributo allo sviluppo di questi protocolli. Questo lavoro è stato supportato da un RO1 NIH accordare ai KZ, NS28182.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Borosilicate Tubing With Filament | Sutter Instrument | BF120-60-10 | ||
| Narishige model PC-10 needle puller | Narishige | Tubes pulled using a heater level of 58.9 |
References
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
- Desai, C. J., Gindhart, J. G., Goldstein, L. S., Zinn, K. Receptor tyrosine phosphatases are required for motor axon guidance in the Drosophila embryo. Cell. 84, 599-609 (1996).
- Sun, Q., Schindelholz, B., Knirr, M., Schmid, A., Zinn, K. Complex genetic interactions among four receptor tyrosine phosphatases regulate axon guidance in Drosophila. Molecular and cellular neurosciences. 17, 274-291 (2001).
- Schmid, A., Schindelholz, B., Zinn, K. Combinatorial RNAi: a method for evaluating the functions of gene families in Drosophila. Trends in neurosciences. 25, 71-74 (2002).
- Fox, A. N., Zinn, K. The heparan sulfate proteoglycan syndecan is an in vivo ligand for the Drosophila LAR receptor tyrosine phosphatase. Curr Biol. 15, 1701-1711 (2005).
