Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine ​​Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Summary

A causa della natura transitoria del pre-mRNA, può essere difficile da isolare e studiare<em> In vivo</em>. Qui, vi presentiamo un romanzo<em> In vitro</emApproccio> per indagare le interazioni RNA-proteina con un pool di sintesi oligo che le piastrelle in regioni selezionate del pre-mRNA.

Abstract

Sequenziamento RNA che la co-immunoprecipitato (co-IP) con le proteine ​​RNA binding ha aumentato la nostra comprensione di splicing, dimostrando che ubicazione vincolante spesso influenza la funzione di un fattore di splicing. Tuttavia, come con qualsiasi strategia di campionamento la possibilità di individuare un RNA legato a un fattore di splicing è proporzionale alla sua abbondanza cellulare. Abbiamo sviluppato un nuovo approccio in vitro per la rilevazione sulle specificità di legame altrimenti transitorio pre-mRNA. Questo approccio utilizza una piscina appositamente progettato oligonucleotide che le piastrelle in introni, esoni, giunzioni di splicing, o altre pre-mRNA. La piscina è sottoposto a una sorta di selezione molecolare. Qui, noi dimostrare il metodo separando la oligonucleotidi in una frazione legati e non legati e utilizzare una strategia a due serie a colori per registrare l'arricchimento di ogni oligonucleotide nella frazione legata. I dati di matrice genera mappe ad alta risoluzione con la capacità di identificare la sequenza-specifica e strutturale determina di ribonucleoproteina (RNP) vincolanti per pre-mRNA. Un vantaggio unico di questo metodo è la sua capacità di evitare il bias di campionamento verso mRNA associati con IP corrente e le tecniche di SELEX, come la piscina è appositamente progettata e sintetizzata dal pre-mRNA sequenza. La flessibilità della piscina oligonucleotide è un altro vantaggio in quanto lo sperimentatore sceglie quali le regioni di studiare e piastrelle in tutto, adattando la piscina alle loro esigenze individuali. Utilizzando questa tecnica, si può dosaggio gli effetti di polimorfismi o mutazioni su vincolante su larga scala o clonare la libreria in un reporter splicing funzionale e identificare oligonucleotidi che si arricchisce nella frazione incluso. Questo romanzo in vitro ad alta risoluzione schema di mappatura fornisce un modo unico per studiare le interazioni RNP con transitorio pre-mRNA specie, la cui bassa abbondanza li rende difficili da studiare con le attuali tecniche in vivo.

Protocol

Piscina progettazione e oligo recupero Il primo passo è quello di progettare il pre-mRNA piscina da studiare. Questo può essere fatto utilizzando il browser UCSC Genome e il download di particolari geni, giunzioni di splicing, o altre aree di interesse. Una volta che le finestre di interesse sono stati selezionati, attraverso le piastrelle computazionalmente con le seguenti: lunghezza leggere dovrebbe essere di 30 nucleotidi con un 10 sovrapposizione nucleotide, quindi ogni oligo è spostato dal 2…

Discussion

Quando si esegue questa procedura il suo importante ricordare che la creazione della piscina è flessibile e aperto a modifiche sia a livello del RNA o proteine. A livello di RNA regioni ortologhi, le mutazioni malattia, polimorfismi o mutazioni casuali possono essere introdotti nella sequenza di oligonucleotidi. A livello della proteina del fattore di RNA binding può essere modificata o modifiche fosforilazione altro post traduzionali. Inoltre, l'ambiente vincolante possono essere manipolati per aumentare o diminu…