ショウジョウバエの幼虫のNMJからシナプス電位を記録するための電気生理学的方法
Summary
ここでは、ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部でシナプス伝達を測定するための電気生理学的方法を説明します。誘発放出は、運動ニューロンの軸索を刺激することによって人工的に開始され、NMJの透過は、筋肉に誘発シナプス後応答によって測定することができる。
Abstract
このビデオでは、我々は、ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部（NMJ）でシナプス伝達を記録するための電気生理学的方法を説明します。幼虫の神経筋システムは、シナプスの生理学と神経伝達の研究のためのモデルのシナプスであり、遺伝学を定義し、実験的操作にアクセスできる状態になっている貴重な研究ツールです。幼虫は、体壁筋肉組織、中枢神経系、および末梢神経を公開するために解剖することができます。ショウジョウバエとその神経支配のパターンの筋肉が十分に特徴付けされていると筋肉が細胞内記録のために簡単にアクセスできます。 A7 – 個々の筋肉は8腹部セグメント、セグメントA2に繰り返されるパターンに配置された30の筋肉と各内での位置や向きによって識別することができます。解剖ショウジョウバエの幼虫は薄いと個々の筋肉と運動ニューロンの軸索の束であると透視可視化することができる<sup> 1</sup>。トランスジェニックコンストラクトは、視覚的に識別するためのまたは特定の組織で遺伝子産物を操作するための標的細胞を標識するために使用することができます。幼虫では、興奮性接合部電位（EJPs）はシナプスでの運動ニューロンからのグルタミン酸の小胞の放出に反応して生成されます。解剖幼虫では、EJPは、細胞内電極で筋肉に記録することができます。活動電位を人為的に、腹側神経節に後方カット穏やかな吸引によってガラスのピペットに引き込まれ、電極で刺激されている運動ニューロンに誘発することができます。これらの運動ニューロンは、刺激の異なる焼成しきい値を持つものがあり、それらを同時に起動したとき、彼らは筋肉の応答を生成します。 NMJシナプスを介して伝送される信号は、運動ニューロン支配するその筋肉に記録することができます。 EJPsとミニチュア興奮性接合部電位（mEJPs）は膜電位の変化として見られている。電気生理学的応答は、修正された最小限の血リンパのような溶液中で室温で記録されます<sup> 2</sup>（HL3）5mMのMgを含む<sup> 2 +</sup>と1.5mMのCaの<sup> 2 +</sup>。誘発EJPsの振幅の変化は、シナプス機能と構造の違いを示すことができます。デジタル化された記録はEJPの振幅、mEJPの周波数と振幅、および量子コンテンツを分析している。
Protocol
Discussion
方法はNMJにおいてシナプス機能の変化を検出するために、比較的迅速かつ広範な手段を提供するここで説明する。 in vivoでインタクトな動物を用いて電気生理学的記録を実行し、遺伝的または薬理学的操作を実行する機能は、ショウジョウバエ神経伝達の生理的および遺伝的側面を調査するための理想的な動物モデルにします。
筋細胞は非常に大きいので、いくつかの2?…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Small Petri dishes (35 x 10 mm) | Becton Dickinson | 1008 | ||
| SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 3097366-1004 | ||
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | 475002-9902 | ||
| Light for microscope | Schott | KLI500 | ||
| Dissection pins | Fine Science Tools | 26002-10 | ||
| pClamp 9 software | Axon CNS, Molecular Devices | PCLAMP 9 STANDARD | ||
| Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | ||
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | ||
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | ||
| Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | ||
| Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | 1B120F-4 | ||
| Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-2000 | ||
| Pipette polisher | Narishiga | MF-83 | ||
| Axon HS-2A head stage | Axon CNS, Molecular Devices | Model HS-2A | ||
| Micromanipulators | Sutter Instruments | MP-85 | ||
| Axoclamp 2B amplifier | Axon CNS, Molecular Devices | AXOCLAMP 2B | ||
| Clampex Software | Axon CNS, Molecular Devices | v 8.2.0.235 | ||
| Mini analysis software. v 6.0.3 | Synaptosoft | |||
| Brownlee Precision Amplifier | Brownlee | Model 410 | ||
| NaCl | Baker | 4058-01 | ||
| KCl | Sigma | p-9333 | ||
| NaHCO3 | Sigma | s6297-1kg | ||
| Trelahose | Sigma | TO167 | ||
| Sucrose | Fisher | bp220-212 | ||
| HEPES | Sigma | h-3375 | ||
| MgCl-6H2O | Sigma | m2670-1kg | ||
| CaCl2 | Fisher | c79-500 | ||
| Master-8 Pulse Generator | A.M.P.I | |||
| Vibration table for electrophysiology set up | Technical manufacturing corporation | |||
| Faraday Cage |
References
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Protocol for dissection of Drosophila larvae. J Vis Exp. , (2008).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).
- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
