Elektrophysiologischen Methoden für die Aufzeichnung Synaptic Potentials aus dem NMJ von Drosophila-Larven
Summary
Hier beschreiben wir elektrophysiologische Methoden zur Messung der synaptischen Transmission an der neuromuskulären Synapse von Drosophila Larve. Evozierte Freisetzung wird künstlich durch die Stimulierung der Motoneuronen Axone initiiert, und die Übertragung durch die NMJ kann durch die postsynaptische Reaktion im Muskel ausgelöst gemessen werden.
Abstract
In diesem Video, beschreiben wir die elektrophysiologischen Methoden zur Erfassung der synaptischen Übertragung an der neuromuskulären Synapse (NMJ) von Drosophila Larve. Die Larven neuromuskuläre System ist ein Modell Synapse für das Studium der synaptischen Physiologie und Neurotransmission und ist eine wertvolle Recherche-Tool, dass die Genetik definiert und ist zugänglich für experimentelle Manipulation. Die Larven können seziert, um den Körper Wand Muskulatur, zentrales Nervensystem und der peripheren Nerven freizulegen. Die Muskeln von Drosophila und ihre Innervationsmuster sind gut charakterisiert und Muskeln sind leicht zu intrazelluläre Aufnahme zuzugreifen. A7 – Einzelne Muskeln können durch ihre Lage und Orientierung innerhalb der 8 Abdominalsegmente mit je 30 Muskeln in ein Muster, das in Segmente A2 wiederholt angeordnet identifiziert werden. Dissected Drosophila-Larven sind dünn und einzelnen Muskeln und Bündeln von Motoneuronen Axone können visualisiert werden Durchleuchtung<sup> 1</sup>. Transgene Konstrukte können verwendet werden, um Zielzellen für die visuelle Identifizierung oder zur Manipulation von Genprodukten in bestimmten Geweben zu kennzeichnen. In Larven, sind exzitatorische Kreuzung Potentiale (EJPs) in Reaktion auf vesikuläre Freisetzung von Glutamat aus den Motoneuronen an der Synapse erzeugt. In seziert Larven können die EJP in den Muskel mit einer intrazellulären Elektrode aufgezeichnet werden. Aktionspotenziale können künstlich in Motoneuronen, die ausgeschnitten hinter der Bauchganglion, gezeichnet in eine Glaspipette durch sanfte Saugwirkung und angeregt mit einer Elektrode hervorgerufen werden. Diese motorischen Neuronen haben unterschiedliche Schwellenwerte feuern, wenn er stimuliert, und wenn sie gleichzeitig feuern, erzeugen sie eine Antwort in den Muskel. Signale über die NMJ Synapse übertragen können in den Muskeln, die die motorischen Neurone innervieren aufgezeichnet werden. Die EJPs und Miniatur-erregenden Kreuzung Potentiale (mEJPs) werden als Änderungen in Membranpotential gesehen. Elektrophysiologische Reaktionen sind bei Raumtemperatur in modifizierter minimal Hämolymphe-like-Lösung aufgenommen<sup> 2</sup> (HL3), die 5 mM Mg enthält<sup> 2 +</sup> Und 1,5 mM Ca<sup> 2 +</sup>. Änderungen in der Amplitude der evozierten EJPs können auf Unterschiede in der synaptischen Funktion und Struktur. Digitalisierte Aufnahmen sind für EJP Amplitude, Frequenz und Amplitude mEJP und quantal analysiert.
Protocol
Discussion
Die hier beschriebenen Methoden eine relativ schnelle und breite Weg, um Veränderungen der synaptischen Funktion an der NMJ erkennen. Die Fähigkeit zur elektrophysiologischen Ableitungen mit intakten Tieren in vivo durchzuführen, und führen genetische oder pharmakologische Manipulationen machen Drosophila ein ideales Tiermodell zur Untersuchung der physiologischen und genetischen Aspekte der Neurotransmission.
Da Muskelzellen sehr groß sind, könnten einige es vorziehen, einen weiteren …
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Small Petri dishes (35 x 10 mm) | Becton Dickinson | 1008 | ||
| SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 3097366-1004 | ||
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | 475002-9902 | ||
| Light for microscope | Schott | KLI500 | ||
| Dissection pins | Fine Science Tools | 26002-10 | ||
| pClamp 9 software | Axon CNS, Molecular Devices | PCLAMP 9 STANDARD | ||
| Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | ||
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | ||
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | ||
| Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | ||
| Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in) | World Precision Instruments, Inc. | 1B120F-4 | ||
| Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-2000 | ||
| Pipette polisher | Narishiga | MF-83 | ||
| Axon HS-2A head stage | Axon CNS, Molecular Devices | Model HS-2A | ||
| Micromanipulators | Sutter Instruments | MP-85 | ||
| Axoclamp 2B amplifier | Axon CNS, Molecular Devices | AXOCLAMP 2B | ||
| Clampex Software | Axon CNS, Molecular Devices | v 8.2.0.235 | ||
| Mini analysis software. v 6.0.3 | Synaptosoft | |||
| Brownlee Precision Amplifier | Brownlee | Model 410 | ||
| NaCl | Baker | 4058-01 | ||
| KCl | Sigma | p-9333 | ||
| NaHCO3 | Sigma | s6297-1kg | ||
| Trelahose | Sigma | TO167 | ||
| Sucrose | Fisher | bp220-212 | ||
| HEPES | Sigma | h-3375 | ||
| MgCl-6H2O | Sigma | m2670-1kg | ||
| CaCl2 | Fisher | c79-500 | ||
| Master-8 Pulse Generator | A.M.P.I | |||
| Vibration table for electrophysiology set up | Technical manufacturing corporation | |||
| Faraday Cage |
References
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Protocol for dissection of Drosophila larvae. J Vis Exp. , (2008).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).
- Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).
